分子間相互作用の可視化と細胞内分子定量イメージング

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11242206
• 研究機関: 国立遺伝学研究所
• 研究代表者: 徳永 万喜洋 国立遺伝学研究所, 構造遺伝学研究センター, 教授 (00192659)
• 研究分担者: 後藤 由季子 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教授 (70252525)
• キーワード: 1分子イメージング / 対物レンズ型全反射照明法 / 低角斜光照明法 / 蛍光顕微鏡 / 細胞質核間輸送 / 定量的画像解析

研究概要

1分子蛍光イメージング技術である対物レンズ型全反射照明法をさらに発展させ、細胞内での1分子蛍光イメージングを実現した。照明用レーザー光の対物レンズへの入射位置を変えることにより、通常の落射照明法、低角斜光照明法、全反射照明法とを簡単に切り替えることができる顕微鏡を作成した。全反射照明法もしくは低角斜光照明法を用いると、低背景で高感度に蛍光試料観察をすることができる。ガラス表面近傍100-200nmの範囲内の試料は全反射照明を用い、それよりも深い場所には低角斜光照明を用いる。
低角斜光照明法を用いて、核膜を介した分子輸送の蛍光1分子イメージングを行った。試料としては、細胞質核間で輸送される分子を蛍光標識し、セミインタクト細胞で観察した。核膜の底を観察したところ、核膜孔の点像からなる蛍光像を得た。点像の蛍光強度と形から、円形の輝点は核膜孔1個1個に対応している。さらに、1分子観察条件にすることにより、細胞質核間で輸送される分子の核膜孔上での1分子蛍光イメージングにも成功した。
単核膜孔および輸送分子の細胞内1分子イメージングは、イメージングとして初めてであるばかりでなく、分子レベルでの定量的な画像解析を可能にした。すなわち、核膜孔の数・通過速度・結合定数・結合分子数といった分子機構解明上重要な量を定量的に求めることができる。増殖細胞では1分間に100万個以上の分子が核膜孔を通過すると言われているが、この一見驚く様な数字を、今回の結果は説明することができる。
当研究は、従来求めることができなかった細胞内での諸量を定量的に求め、分子機構を解明する新しい手法として、1分子イメージング法が有用である事を示している。

研究成果

• [文献書誌] Yanagida T.: "Single-motor mechanics and models of the myosin motor."Philos.Trans.R.Soc.Lond.B. 355. 441-447 (2000)
• [文献書誌] Graves,J.D.: "Both phosphorylation and caspase-mediated cleavage contribute to regulation of the Ste-20-like Protein Kinase Mst1 during CD95/Fas-induced apoptosis."J.Biol.Chem.. (in press). (2001)
• [文献書誌] Fujishiro,M.: "MKK6/3 and p38 MAPK Pathway Activation is not Necessary for Insulin-Induced Glucose Uptake, but Regulates Glucose Transporter Expression."J.Biol.Chem.. (in press). (2001)
• [文献書誌] Ura,S.,Masuyama,N.: "MST1-JNK promotes apoptosis via caspase-dependent and -independent pathways."Genes to Cells.. (in press). (2001)
• [文献書誌] 喜多村和郎: "ミオシン頭部1分子はATP分解1回で複数ステップ動く:1分子補足・操作によるルースカップリングの直接証拠"生物物理. 40(2). 89-93 (2000)
• [文献書誌] 徳永万喜洋: ""新生物物理の最前線"日本生物物理学会 編"講談社ブルーバックス. (2001)