cameleon1分子イメージングによる局所的カルシウム動態の解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11242208
• 研究種目: 特定領域研究(B)
• 研究機関: 理化学研究所
• 研究代表者: 宮脇 敦史 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, チームリーダー(研究職) (80251445)
• 研究分担者: 水野 秀昭 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員
• キーワード: 2光子励起 / エバネセント / 1分子イメージング / 蛍光エネルギー移動 / Green Fluorescent Protein / Red Fluorescent Protein / cameleon

研究概要

2光子励起顕微鏡やエバネセント励起(全反射照明)で1分子イメージングするためのサンプルを調整した。それらは、カルシウム指示薬である長波長(yellow cameleon)および、カルモデュリンとその標的ペプチドであるM13ペプチドとの可逆的相互作用をみるためのサンプルである。
ところで本年度研究の開始に前後して(1999年秋)、我々にとって非常に意味のある発表が為された。イソギンチャクからRed Fluorescent Protein(RFP)がクローニングされたのである。RFPをアクセプターとしてFRET(蛍光のエネルギー移動)を実現すれば、cameleonを更に長波長にシフトすることができる。長波長の励起光を用いると、背景光を比較的容易に減らすことができる。実際1分子イメージング実験では、いかに背景光を除去するかが重要である。しかし、現存のRFPはFRETのアクセプターとして数々の問題点を有することが判明した。そこで、現在RFPの蛍光活性を改良することに重点を置いて研究を進めている。アミノ酸置換を導入したRFPを大腸菌コロニーの中で、即ちプレートの上で解析するシステムをセットアップした。改善されたRFPはcameleonのみならず、細胞生物学におけるイメージング技術(1分子イメージングを含む)に応用されるべきものであり、我々の研究に対する期待は大きい。

研究成果

• [文献書誌] Miyawaki A., Tsien R. Y.: "Monitoring Protein Conformations and Interactions by Fluorescence Resonance Energy Transfer Between Mutants of Green Fluorescent Protein"Methods in Enzymology, Chimeric Proteins. (1999)
• [文献書誌] Miyawaki A., Llopis J., Mizuno H., Jelink K., Tsien R. Y.: "Cameleons as cytosolic and intra-organellar calcium probes"Oxford University Press, Calcium Signaling : A Practical Approach. (1999)
• [文献書誌] Mikoshiba K., Furuichi T., Miyawaki A., et al.: "Role of Inositol 1, 4, 5-Trisphosphate(IP_3) Receptor/Ca^<2+> Signaling in Cell Function"Japan Scientific Societies Press, Challenges for Neuroscience in the 21^<st> Century. (1999)
• [文献書誌] Matsushita F., Miyawaki A., Mikoshiba K.: "Vomeroglandin/CRP-ductin is strongly expressed in the gland associated with the mouse vomeronasal organ : identification and characterization of mouse vomeroglandin"Biochemical and Biophysical Research Communications. (2000)