cameleon1分子イメージングによる局所的カルシウム動態の解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11242208
• 研究機関: 理化学研究所
• 研究代表者: 宮脇 敦史 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, チームリーダー(研究職) (80251445)
• 研究分担者: 水野 秀昭 理化学研究所, 細胞機能端探索技術開発チーム, 研究員 (80301779)
• キーワード: RFP / GFP / FRET / Ca^<2+>センサー / カルモデュリン / pericam / cameleon / サファイア

研究概要

我々は六放サンゴに由来するRFPの構造学的特性、蛍光特性を解析した。これらの知見を基に、オワンクラゲGFPのmutantの一つであるサファイアをドナー、RFPをアクセブターにすると非常に効率のよいFRETが実現できることを見出した。このペアの利点の一つとして、サファイア、RFPともにpHに対して全く抵抗性をもつことがあげられる。従って両者を組み込んで作製されたCa^<2+>指示薬Red cameleonは、pH変化が激しく起こる神経細胞でのCa^<2+>イメージングに適することが示された(Biochemistry,2001)。
我々は、GFPのβ-can構造にメスを入れたものに、Ca^<2+>センサーとしてのカルモデュリンとその標的ペプチドを組み込み、Ca^<2+>濃度に従って蛍光特性を変えるGFPを創り出した。我々が最近開発したのがCa^<2+>感受性GFP"pericam"である。発色団近傍のアミノ酸置換によってpericamのパリエーションを増やし、個々についても明るさなどの向上を図った。現在、1波長励起1波長測光型のものとして、Ca^<2+>によって蛍光強度が増大する"flash-pericam"、蛍光強度が減少する"inverse-pericam"、Ca^<2+>によって色が変わる2波長励起1波長測光型の"ratiometric-pericam"がある(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001)。

研究成果

• [文献書誌] Matsushita F.,Miyawaki A.,and Mikoshiba K.: "Vomeroglandin/CRP-ductin is strongly expressed in the glands associated with the mouse vomeronasal organ : Identification and characterization of mouse vomeroglandin"Biochemical and Biophysical Research Communications. 268. 275-281 (2000)
• [文献書誌] Sawano A,and Miyawaki A.: "Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis"Nucleic Acids Research(アドレスhrrp://nar.oupjounals.org/cgi/reprint/28/16/e78.pdf). 28,No.16. e78 (2000)
• [文献書誌] Mizuno H.,Sawano A.,Eli P.,Hama H.and Miyawaki A.: "Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer"Biochemistry. 40(8). 2502-2510 (2001)
• [文献書誌] Nagai T.,Sawano A.,Park E.,and Miyawaki A.: "Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense to Ca^<2+>"Proceeding National Academy Science USA. 98(6). 3197-3203 (2001)