低分子量G蛋白が細胞膜で情報を受け取るメカニズムの可視化

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11242209
• 研究種目: 特定領域研究(B)
• 研究機関: 国立国際医療センター(研究所)
• 研究代表者: 松田 道行 国立国際医療センター研究所, 臨床病理研究部, 部長 (10199812)
• 研究分担者: 望月 直樹 国立国際医療センター研究所, 臨床病理研究部・組織形態研究室, 室長 (30311426)
• キーワード: G蛋白 / Ras / Rap1 / GFP

研究概要

RasファミリーG蛋白の一つRap1の活性化を可視化するために、本年度は、材料の収集およびシステムの構築にあたった。
1.まず、Rap1の活性化を試験管内でリアルタイムに観察するための方法としてmant-GDPを結合させ、その解離を蛍光分光光度計でモニターする系を構築した。Rap1は大腸菌にて産生させ、グルタチオンカラムで精製した。mant-GDPは同仁化学に作成を依頼した。交換反応を測定するためのC3Gは触媒領域のみを大腸菌にて産生させ、同様に精製した。Rap1は安定性が悪く、長時間のモニターには耐えないが、1時間以内であれば、効率よくリアルタイムで交換反応をモニターできた。
2.細胞内でのRap1活性化をモニターするために、タイムラプス顕微鏡を構築した。カールツァイス社製の顕微鏡に日本ローパー社製の画像解析装置を接続した。また、長時間のモニターに細胞が耐えるように、CO2インキュベーターならびに温度コントローラーも接続した。
3.GFP関連蛋白の構築を行った。すなわち、Rap1蛋白を、GFP、YFP、CFP、BFP、RFPとの融合蛋白として産生する系を作成した。それぞれを293T細胞に発現させ確かに蛍光を発生することを確認した。これら蛍光蛋白の融合によりRap1の分布に明らかな差異は認められなかった。今後、活性化により蛍光の変化する変異体の構築にあたる。

研究成果

• [文献書誌] Mochizuki N, et al.: "Crk Activation of JNK via C3G and R-Ras"J Biol Chem. (in press). (2000)
• [文献書誌] Mochizuki N, et al.: "Activation of ERK/MAPK pathway by an isoform of rap1GAP associated with Gαi"Nature. 400. 891-894 (1999)
• [文献書誌] Nishihara H, et al.: "Non-adherent cell-specific expression of DOCK2, a member of the human CDM-family proteins"Biochim Biophys Acta. 1452. 179-187 (1999)
• [文献書誌] Katayama H, et al.: "EGF-dependent dissociation of Crk proto-oncogene product from the epidermal growth factor receptor in human glioma cells"Jpn J Can Res. 90. 1096-1103 (1999)
• [文献書誌] Ichiba T, et al.: "Activation of C3G Guanine Nucleotide Exchange Factor for Rap1 by Phosphorylation of Tyrosine 504"J. Biol. Chem.. 274. 14376-14381 (1999)