カイコキモトリプシンインヒビターの生理機能に関する研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11306005
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 藤井 博 九州大学, 農学部, 教授 (10038268)
• 研究分担者: 原 敏夫 九州大学, 農学部, 助教授 (50117222) ; 麻生 陽一 九州大学, 農学部, 助教授 (10117054) ; 河口 豊 九州大学, 農学部, 助教授 (80038306) ; 伴野 豊 九州大学, 農学部, 助教授 (50192711)
• キーワード: カイコ / Bomyxmori / キモトリプシンインヒビター / CI-13遺伝子 / CI-3cDNA塩基配列決定 / CI-8 / 消化液プロテアーゼ / 35k protease

研究概要

1.体液Clの構造と機能の解析:変異Clを作製するためにCl-13遺伝子の構造を明らかにした。Cl-13は63個のアミノ酸からなる分子量7000のタンパク質である。Cl-13のN-末端アミノ酸配列に基づき作成したプライマーと脂肪組織より抽出したmRNAを用いたRT-PCR法でcDNAを合成し、プラスミドにクローニングし塩基配列を決定した。開始コドンから終止コドンまで全長261ヌクレオチドより成っていた。
2.Clと反応する細胞内在性プロテアーゼの検出、同定・分離:カイコ消化液中には数種類のプロテアーゼが存在する。そこでClと反応する内在性のプロテアーゼの存在を明らかにする一環として、手始めに精製Cl-13およびCl-8を用いて消化液プロテアーゼ活性に対する阻害作用を調べた。その結果、Cl-13は消化液プロテアーゼ活性を阻害しなかった。一方、Cl-8はプロテアーゼ活性を阻害した。次にCl-8が消化液中の複数あるプロテアーゼのどの成分に対して阻害活性を示すのかを調べたところ、分子量35kのプロテアーゼ活性を阻害することが明かになった。次いで消化液から35kプロテアーゼの分離を行った。硫安塩析、ButrylToyopearl DEAE Sephacelカラムクロマトグラフィにより、SDS-電気泳動的に均一のタンパク質を分離した。本プロテアーゼの分子量をSDS-電気泳動法で求めたところは35kDaであった。タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、精製Clと蛍光標識特異抗体を用いたブロッテングオーバーレイ法によりClと反応するタンパク質を検出、同定する。他方、脂肪組織、中腸組織摩砕物からClを用いたアフィニティカラムクロマト法を用いてClと親和性のあるタンパク質を分離する。
3.脂肪組織および中腸組織に存在する組織特異的Cl-8レセプターの探索、同定、分離:脂肪組織のタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、精製Clと蛍光標識特異抗体を用いブロッテングオーバーレイ法により、Clと反応するタンパク質を検出した。

研究成果

• [文献書誌] Yamamoto: "Isolation and characterization of prophenoloxidase isorms from the sillworm,Bombyx mori(a80 strain)"J,Seric,Sci,Jpn.. 68・1. 65-72 (1999)
• [文献書誌] Tamura,T.: "Rescue of oq,and ogt mutants by injection of xanthine oxidase"J,Seric,Sci,Jpn.. 68・2. 111-117 (1999)
• [文献書誌] 河口 豊: "カイコ矮小卵における卵細胞質のサイズが次代の幼虫発育におよぼす影響"日本蚕糸学雑誌. 68・3. 245-244 (1999)
• [文献書誌] 姜 永煌: "カイコ消化液35kプロテアーゼの精製とその性質(in press)"日本蚕糸学雑誌. 66・1. (2000)
• [文献書誌] Koji Shirai: "Synthesis and resorption of a humoral chymotrypsin inhibitor,CI-8,by fat body of the silkworm,Bombyx mori,(in press.)"Insect Biochem,Mol,Biol.. (2000)
• [文献書誌] Hitoshi Arai: "Purification and charactterization of a major esterase BesB from hemolymph of the silkworm,Bombyx mori,(in press.)"J,Seric,Sci,Jpn.. 66・1. (2000)