カイコキモトリプシンインヒビターの生理機能に関する研究

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11306005
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 藤井 博 九州大学, 大学院・農学研究院, 教授 (10038268)
• 研究分担者: 原 敏夫 九州大学, 大学院・農学研究院, 助教授 (50117222) ; 麻生 陽一 九州大学, 大学院・農学研究院, 助教授 (10117054) ; 河口 豊 九州大学, 大学院・農学研究院, 助教授 (80038306) ; 伴野 豊 九州大学, 大学院・農学研究院, 助教授 (50192711)
• キーワード: カイコ / Bomyxmon / キモトリプシンインヒビター(CI) / CI-10の精製 / CI-8結合蛋白質 / 中腸組織 / リガンドアッセイ法 / 35k protease遺伝子

研究概要

1.体液CIの遺伝子の構造と機能の解析 体液中に存在する16種類のClのうち,Ict-Bに支配されているCI-9は微量のために分離精製が行われていなかったが、キモトリプシンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いることによりCI-9を電気泳動的均一な蛋白質として分離できた。飛行時間型質量測定装置でCI-9の質量を測定した結果、7,167であった。N-末端アミノ酸分析を行い、40残基のアミノ酸配列を決定した。活性部位の3アミノ酸配列はこれまでに明らかにしたKunitz型CIとは異なっていた。CI-3と-4を分離し、N-末端アミノ酸分析を行い15アミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列を基に作成したプライマーを用いてRT-PCRを行ったがDNA断片が増幅しなかった。
2.培養細胞を用いたCI遺伝子の発現系の構築 CI-8およびCI-13をベクターに入れてSf9細胞で発現させた。しかし合成量が少なかったので、培養条件の検討を行っている。培養液からの精製を行っている。
3.CI-13遺伝子ゲノム構造の解析を行った。CI-9遺伝子は1837塩基で2つのイントロンと3つのエクソンから構成されていた。
4.CI-8レセプターの同定リガンドアッセイ法を用いて、変態期における中腸組織に分子量60kDaのCI-8レセプターを見つけた。現在分離と精製を進めている。
5.CIと反応する内在性プロテアーゼの構造と機能の解析 精製35KプロテアーゼのN-末端アミノ酸配列に基づきプライマーを作り、RT-PCR反応を行い、35Kプロテアーゼ遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。

研究成果

• [文献書誌] Qing-You Xia et al.: "Identifcatioh of three annexin IX isoforms genetrated by alternative splicing of the carboxyl-terminal exon in silkworm, Bombyx mori"Insect Biochemistrory and Molecular Biology. 32. 9-14 (2001)
• [文献書誌] Yutaka.Banno et al.: "Inheritance of one cocoon shape mutant named "flossy cocoon" of the silkworm, Bombyx mori"Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 70. 189-192 (2001)
• [文献書誌] Yutaka Kawaguchi et al.: "Genetic analysis of the maternally conditioned "mosaic of Tanaka" mutant in Bombyx mori"Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 70. 193-198 (2001)
• [文献書誌] Takashi Nakamura et al.: "Genetic of the "wild silkworm translucent" mutant (ows) discovered in the progenies after the cross between the domesticated silkworm, Bombyx mori and the sild mulberry silkworm Bombyx mandarina"Int J.Wild Silkworm and Silk. 6. 7-10 (2001)
• [文献書誌] Kohji Yamamoto et al.: "Change in phenoloxidase and its precursor during silkworm (a80 strain) development"J.Fac.agr.Kyushu Univ. 45・2. 478-493 (2001)