I型ヘルパーT細胞の誘導によるトキソプラズマ病の制御

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11306019
• 研究機関: 日本大学
• 研究代表者: 見上 彪 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20091506)
• 研究分担者: 壁谷 英則 日本大学, 生物資源科学部, 助手 (10318389) ; 丸山 総一 日本大学, 生物資源科学部, 助教授 (30181829) ; 酒井 健夫 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (50147667) ; 玄 学南 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 助教授 (10292096) ; 長澤 秀行 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 教授 (60172524)
• キーワード: T.gondii / IL-12 / FHV-1 / 組換えワクチン / TgSAG1 / TgSAG2 / TgSRS2 / TgROP2

研究概要

得られた主な研究成果は以下のとおりである。
1)ネコサイトカインIL-12のクローニングと発現
Th1細胞誘導に最も重要と言われているIL-12のクローニングを行った。ネコ脾臓細胞よりcDNAライブラリーを作製した後、ヒトIL-12 p35とIL-12 p40のcDNAをプローブとしてスクリーニングを行った。得られたネコIL-12 p35とIL-12 p40遺伝子をCOS細胞で発現し、その生物活性を調べたところ、ネコ末梢血リンパ球に対するIFN-γ誘導とCTL増強活性が認められた。
2)T.gondiiの主要抗原遺伝子のクローニングと発現
T.gondii RH株より得られたcDNAを鋳型とし、主要抗原とされるP22、P30、P43、P54、SRS1遺伝子をPCR法によりクローニングした。大腸菌発現系を用いてそれぞれの遺伝子を発現・精製し、マウスに免疫した後にT.gondii Beverley株にて攻撃したところ、組換えP22とSRS1の感染防御効果が最も顕著であった。また、in vitro虫体増殖抑制試験を行ったところ、何れの抗血清にも虫体増殖抑制活性が認められた。
3)T.gondiiの主要抗原を発現する組換えネコヘルペスウイルス(FHV-1)の構築
P22(SAG2)、P30(SAG1)、P54(ROP2)、SRS1遣伝子をCAGプロモーターに制御される発現ユニットを作製した後にFHV-1のトランスファーベクターpfTK-SBに挿入しpfTK/P22、pfTK/P30、pfTK/P54、pfTK/SRS1を得た。pfTK/P22、pfTK/P30、pfTK/P54、pfTK/SRS1と感染性FHV-1DNAをCRFK細胞にco-transfectした後に、TKに特異な抗ヘルペスウイルス剤であるAraTを用いて選択し、組換えFHV-1/TgP22、FHV-1/TgP30、FHV-1/TgP54、FHV-1/SRS1をそれぞれ得た。組換えネコヘルペスウイルスにより発現されたP22、P30、P54、SRS1はそれぞれT.gondii虫体由来の天然型タンパク質に類似した抗原性を保持していることが確認された。一方、IL-12を発現する組換えネコヘルペスウイルスは現在作製中である。
4)組換えネコヘルペスウイルス接種ネコにおける感染防御効果
組換えFHV-1/TgP22、FHV-1/TgP30、FHV-1/TgP54、FHV-1/SRS1をそれぞれSPFネコに経鼻・口接種(1x10^6PFU/頭)した後に、T.gondii Beverley株を経口投与(1x10^4/頭)し感染防御効果を評価した。何れの接種群でも完全な感染防御効果は得られなかったが、糞便中に排泄されるオーシスト量の減少が認められた。また、in vitro虫体増殖抑制試験を行ったところ、何れの抗血清にも虫体増殖抑制活性が認められた。これらの各組換えウイルスとIL-12を発現する組換えウイルスをネコに混合接種し、IL-12のTh1細胞誘導によるアジュバント効果を調べることが今後に残されている課題である。

研究成果

• [文献書誌] Mishima, T. et al.: "Recombinant feline herpesvirus type 1 expressing Toxoplasma gondii ROP2 antigen inducible protective immunity in cats"Parasitol. Res.. 88. 144-149 (2002)
• [文献書誌] Nishkawa, Y. et al.: "Mechanisms of apoptosis in murine fibroblasts by two intracellular protozoan parasites, Toxoplasma gondii and Neospora caninum"Parasite Immnol.. 24. 347-354 (2002)
• [文献書誌] Huang, X. et al.: "Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant SAG2 for diagnosis of Toxoplasma gondii infection in cats"J. Parsitol.. 88. 804-807 (2002)
• [文献書誌] Nishikawa, Y. et al.: "Vaccine development against Neospora caninum infection"J. Vet. Med. Sci.. 64. 1-5 (2002)
• [文献書誌] Huang, X. et al.: "Characterization of Toxoplasma gondii SAG2 expressed in insect cells by recombinant baculovirus and evaluation of its diagnostic potential in an ELISA"Clin. Diagn. Lab. Immunol.. 9. 1343-1347 (2002)
• [文献書誌] Makala, L. et al.: "Phenotype and function of murine peritoneal cavity macrophage derived-dendritic cells"J. Vet. Med. Sci.. 64. 813-820 (2002)
• [文献書誌] Maruyama, S. et al.: "Seroprevalence of Bartonella henselae, Toxoplasma gondii, FIV, and FeLV infections in domestic cats in Japan."Microbiol. Immunol. 47. 147-153 (2003)