| 研究課題/領域番号 |
11307017
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
名和田 新 九州大学, 大学院・医学研究院, 教授 (10038820)
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| 研究分担者 |
後藤 公宣 九州大学, 医学部・附属病院, 助手 (90284512)
柳瀬 敏彦 九州大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (30239818)
高柳 涼一 九州大学, 大学院・医学研究院, 教授 (30154917)
野村 政壽 九州大学, 医学部・附属病院, 助手 (30315080)
岡部 泰二郎 九州大学, 医学部・附属病院, 助手 (40264030)
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| キーワード | Yeast two-hybrid assay / AR AF-1 / GSTプルダウン / cDNA cloning |
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| 研究概要 |
我々はアンドロゲン受容体(AR)AF-1領域に結合するAR特異的転写共役因子のクローニングを試みている。平成11年度では、AR AF-1領域に、分子量約90kDaのタンパク質が結合し、正常AR遺伝子を有する完全型睾丸性女性化症患者ではこの結合が観察されないことを線維芽細胞のwhole cell lysateを用いたGSTプルダウン法で証明した。そこで、平成12年度では、酵母two hybrid assayを用いてこのタンパク質のcDNAクローニングを試みた。
まず、核抽出液を線維芽細胞より得、GSTプルダウン法によりこの90kDaのタンパク質が核タンパク質であることを確認した。正常ヒト線維芽細胞よりcDNAライブラリーを作製し、Clontech社のMatchmaker LexA Two-hybrid Systemを用いて、AR AF-1領域cDNAをbaitとしてtwo hybrid assayを施行した。1000000個のIndependent colonyをスクリーニングし、陽性クローンのcDNA断片を用いて再度ヒト線維芽細胞cDNAライブラリーをスクリーニングした結果、分子量102 kDaの既知のタンパク質をコードする完全長cDNAを得た。このタンパク質はレポーター実験で用量依存的にリガンド依存性AR活性、リガンド非依存性AR AF-1活性を3から5倍増強した。現在、エストロゲン受容体、グルココルチコイド受容体に対する影響を観察すると同時に、免疫共沈実験、GSTプルダウン法を用いて、このタンパク質のAR AF-1領域への結合を確認中である。
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