糖鎖の薬物分子認識機能の精密微量解析法の構築

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11307054
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 中川 照眞 京都大学, 薬学研究科, 教授 (70025708)
• 研究分担者: 澁川 明正 京都大学, 薬学研究科, 助教授 (30170913) ; 黒田 義弘 京都大学, 薬学研究科, 助教授 (90093236)
• キーワード: 糖タンパク質糖鎖 / 薬物・タンパク結合解析 / 糖鎖ミクロ不均一性 / 高速先端分析法 / 電子スプレー型飛行時間質量分析 / Naチャンネル蛋白 / プリオン蛋白

研究概要

代表的な糖タンパク質としてα_1-酸性糖タンパク(AGP)を取り上げ、塩基性薬物エナンチオマーとの立体選択的結合に対する糖鎖やアミノ酸配列の影響を明らかにするため、キャピラリー電気泳動(CE)および質量分析(MS)を用いる超微量解析法を開発し、AGPの構造的多様性が薬物認識機能にどのように関与するかを検討し、以下の結果を得た。
(a)薬物結合部位近傍のみに存在する2本鎖糖鎖は、塩基性薬物(disopyramide,verapamil)のエナンチオマーに対する光学認識能を殆ど示さない。
(b)genetic variantの一つであるA-variantは、F1*S-variantに比べてdisopyramideに対してはより強い光学認識能を有するが、verapamilについてはほぼ同等の認識能を有する。
(c)sheathless ESI法に基づくCE/MS法を用いることにより、従来より1桁以上高い感度でAGPの各variantに由来するトリプシン消化ペプチドを分析できた。
一方、糖鎖のミクロ不均一構造が糖蛋白質の機能と構造に果たす影響を解明するために、前者に対してはNaチャンネル蛋白を、後者に対してはプリオン蛋白を標的として、それぞれの構造あるいは機能の中核となる部位のペプチドフラグメントを合成し、NMR、分子動力学計算、CDスペクトルを用いた構造化学的研究を行い、以下の知見を得た。
(a)ゲート機構を担う部位のNaチャンネルペプチドもプリオン蛋白ペプチドも、溶媒の種類および組成に依存した疎水性環境に呼応して構造変化が起きやすい。
(b)親水性基と疎水性基を合わせ持つ糖はその種類、並び方、分枝の違いに基づいてミクロ誘電率の異なった疎水性空間を局所的に形成しうる事が、蛋白質の局所的な構造変化を引き起こし、その結果として機能調節やアミロイド繊維の形成(プリオン蛋白)に関わるとことが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Yukihiro Kuroda et al.: "Role of Biantennary Glycans and Genetic Variants of Human α_1-Acid Glycoprotein in Enantioselective Binding of Basic Drugs as Studied by High Performance Frontal Analysis/Capillary Electrophoresis"Pharm.Res.. (印刷中).
• [文献書誌] Akimasa Shibukawa et al.: "Plasma protein binding study of oxybutynin by high-performance frontal analysis"J.Chromatogr.B. (印刷中).
• [文献書誌] Akimasa Shibukawa et al.: "Binding study of desethyloxybutynin using high-performance frontal analysis method"J.Chromatogr.B. (印刷中).
• [文献書誌] Yukihiro Kuroda et al.: "Structural study of the sodium channel inactivation gate peptide including an isoleucine-phenylalanine-methionine motif and its analogous peptide (phenylalanine/glutamine) in trifluoroethanol solution and SDS micelles"J.Peptide Res.. 56・3. 172-184 (2000)
• [文献書誌] Yukihiro Kuroda et al.: "Interactions between local anesthetics and Na^+-channel inactivation gate peptides in phosphatidylserine liposomes as studied by ^1H-NMR spectroscopy"Chem.Pharm.Bull.. 48・9. 1293-1298 (2000)
• [文献書誌] Yukihiro Kuroda et al.: "Orientations and locations of local anesthetics benzocaine and butamben in phospholipid membranes as studied by 2H NMR spectroscopy"J.Membr.Biol.. 177・2. 117-128 (2000)
• [文献書誌] Yukihiro Kuroda et al.: "Oligopeptide-mediated stabilization of the α-helix of a prion protein peptide"J.Am.Chem.Soc.. 122. 12596-12597 (2000)
• [文献書誌] Kazuhide Miyamoto et al.: "Solution structures of the inactivation gate particle peptides of rat brain type-IIA and human heart sodium channcls in SDS micelles"J.Peptide Res.. 57. (2001)