ヒトメタロチオネインの立体構造と生体防御機能との相関に関する研究

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11450315
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 室岡 義勝 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (60029882)
• 研究分担者: 平山 令明 東海大学, 開発工学部, 教授 (70238393) ; 小野 比佐好 大阪大学, 遺伝情報実験施設, 助手 (40224274) ; 山下 光雄 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (40220347)
• キーワード: 重金属 / メタロチオネイン / タンパク質工学 / SH基高含有タンパク質 / 重金属結合タンパク質

研究概要

メタロチオネインの構造と生体防御機能との相関について検証するため、タンパク質工学手法を用いてヒトメタロチオネインのアミノ酸置換を行い、タンパク質の主体構造を変換することにより重金属結合能、放射線耐性機能、活性酸素によるDNA損傷に対する防御機能及びフリーラジカルとの反応性に及ぼす影響を調べる目的で、下記の研究を行った。
1)変異メタロチオネインの重金属結合能の解析
平成11年度に確立した大腸菌による野生型および変異型ヒトメタロチオネインタンパク質の生産精製方法を用いて、目的タンパク質を精製し、原子吸光光度計により重金属結合量を測定した。また重金属親和性を評価するために、pHタイター法を導入した。現在、11種類の変異タンパク質をインテイン融合タンパク質として高発現させ、精製の後、変異タンパク質のみを回収した。11種類の多くは野生型メタロチオネインと比較して、重金属結合量や親和性に違いがなかったが、幾種かは結合量が7から8原子となったもの、あるいは5以下に減少したものや親和性に違いが生じたものなどが得られた。
2)三次構造モデルの構築と重金属特異的結合能を有するタンパク質の開発
コンピューターグラフィックによりアミノ酸置換メタロチオネイン、および2量体、4量体の立体構造を解析し、重金属特異的結合能を解析する研究を行った。

研究成果

• [文献書誌] S.-H.Hong: "Molecular design of novel metal-binding oligomeric human metallothioneins."Applied Microbiology and Biotechnology. 54. 84-89 (2000)
• [文献書誌] H.Nakayama: "Ectoine, the compatible solute of Halomonas elongata, confers hyperosmotic tolerance in cultured tobacco cells."Plant Physiology. 122. 1239-1247 (2000)
• [文献書誌] P.Kiatpapan: "Characterization of pRGOl, a plasmid from Propionibacterium acidipropionici, and its use for development of a host-vector system in Propionibacteria."Applied and Environmental Microbiology. 66(11). 4688-4695 (2000)
• [文献書誌] P.Kiatpapan: "Molecular characterization of Lactobacillus plantarum genes for β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III (fabH) and acetyl coenzyme A carboxylase (accBCDA) which are essential for fatty acid biosynthesis."Applied and Environmental Microbiology. 67(1). 426-433 (2001)
• [文献書誌] S.-H.Hong: "High yield expression and single step purification of human thionein/metallothionein."Protein Expression and Purification. 21(1). 243-250 (2001)
• [文献書誌] Y.Murooka: "Genetic design of stable metal-binding biomolecules, oligomeric metallothioneins"Biocatalysis and Biotransformation. 9(3)(印刷中). (2001)
• [文献書誌] 鈴木孝仁 ら 編集: "微生物の資材化:研究の最前線"ソフトサイエンス社. 364 (2000)