ヒトメタロチオネインの立体構造と生体防御機能との相関に関する研究

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11450315
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 室岡 義勝 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (60029882)
• 研究分担者: 平山 令明 東海大学, 開発工学部, 教授 (70238393) ; 小野 比佐好 大阪大学, 遺伝情報実験施設, 助手 (40224274) ; 山下 光雄 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (40220347)
• キーワード: 重金属 / メタロチオネイン / タンパク質工学 / SH基高含有タンパク質 / 重金属結合タンパク質

研究概要

メタロチオネインの構造と生体防御機能との相関について検証するため、タンパク質工学手法を用いてヒトメタロチオネインのアミノ酸置換を行い、タンパク質の主体構造を変換することにより重金属結合能、放射線耐性機能、活性酸素によるDNA損傷に対する防御機能及びフリーラジカルとの反応性に及ぼす影響を調べる目的で、下記の研究を行った。
1)三次元構造モデルの構築と重金属特異的結合能を有するタンパク質の開発
すでに構築したホモロジー分子モデルおよび関連する有機金属錯体の構造データを検討し、既存のメタロチオネインと重金属が配位するのと同じ様に、きちんと4配位で結合する新規な金属結合位置の導入を目的として、置換できるアミノ酸残基を探索した。その結果、11番目のアスパラギン酸と28番目のセリンをシステインに置換した変異型メタロチオネインが提案できた。
2)変異メタロチオネインの重金属結合能の解析
部位特異的変異導入法を用いてアミノ酸の置換を行い、変異導入後はDNA塩基配列を決定して変異を確認した。そのタンパク質を用いてカドミウムと亜鉛を取り込ませ、解析サンプルに用いた。原子吸光光度計による重金属結合量を測定した結果、野生型ヒトメタロチオネインは、1分子当たりカドミウム及び亜鉛が7.1原子結合していたが、変異型ヒトメタロチオネインは、1分子当たりカドミウム及び亜鉛が8.0原子結合していた。続いてpH滴定による金属の解離度を求めた結果、50%のカドミウムを解離するpHは野生型で3.76、変異型で3.35であり、変異型メタロチオネインはより酸性領域までカドミウムと結合していたことが示唆された。以上の結果、変異ヒトメタロチオネインタンパク質は、新規な重金属結合能が付与されたものと思われる。

研究成果

• [文献書誌] S.H.Hong: "High yield expression and single step purification of human thionein/metallothionein"Protein Expression and Purification. 21(1). 243-250 (2001)
• [文献書誌] H.Kobayashi: "DNA synthesis and fragmentation in bacteroids during Astragalus sinicus root nodule development"Biosc.Biotech.Bichem. 65(3). 510-515 (2001)
• [文献書誌] K.Nanda: "Characterizations of acetic acid bacteria in traditional acetic acid fermentation of rice vinegar(komesu)and unpolished rice vinegar(kurosu)produced in Japan"Applied and Environmental Microbiology. 67(2). 986-990 (2001)
• [文献書誌] P.Kiatpapan: "Construction of an expression vector for propionibacteria and its use in production of 5-aminolevulinic acid by Propionibacterium freudenreichii"Appl.Microbiol. Biotechnol. 56. 144-149 (2001)
• [文献書誌] Y.Murooka: "Genetic design of stable metal-binding biomolecules, oligomeric metallothioneins"Biocatalysis and Biotransformation. 19. 399-412 (2001)
• [文献書誌] P.Kiatpapan: "Heterologous expression of a gene encoding cholesterol oxidase in probiotic strains of Lactobacillus plantarum and Propionibacterium freudenreichii under the control of native promoters"J.Biosci. Bioeng.. 92(5). 459-465 (2001)
• [文献書誌] S.Nishikawa, Y.Murooka: "Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. Vol.18"Intercept, Andover, England(ed.S.E.Harding). 149-170 (2001)