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2002 年度 研究成果報告書概要

ヒトメタロチオネインの立体構造と生体防御機能との相関に関する研究

研究課題

研究課題/領域番号 11450315
研究種目

基盤研究(B)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 生物・生体工学
研究機関大阪大学

研究代表者

室岡 義勝  大阪大学, 大学院・情報科学研究科, 教授 (60029882)

研究分担者 平山 令明  東海大学, 大学院・医学研究科, 教授 (70238393)
小野 比佐好  大阪大学, 遺伝情報実験センター, 助手 (40224274)
山下 光雄  大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (40220347)
研究期間 (年度) 1999 – 2002
キーワード重金属 / メタロチオネイン / タンパク質工学 / SH基高含有タンパク質 / 重金属結合タンパク質 / DNA binding / Arsenic
研究概要

メタロチオネインの構造と生体防御機能との相関について検証するため、タンパク質工学手法を用いてヒトメタロチオネインのアミノ酸置換を行い、タンパク質の主体構造を変換することにより重金属結合能、放射線耐性機能、活性酸素によるDNA損傷に対する防御機能及びフリーラジカルとの反応性に及ぼす影響を調べる目的で、下記の研究を行った。
1)まず大腸菌による野生型および変異型ヒトメタロチオネインタンパク質の生産方法と精製方法を確立した。
2)以前当研究室でデザインした2量体および4量体メタロチオネインタンパク質を精製し、ZnおよびCd結合量がモノマータンパク質の2倍および4倍となることを確認した。
3)重金属親和性を評価するために、pHタイター法を導入した。
4)11種類の変異タンパク質を構築し、インテイン融合タンパク質として高発現させた。幾つかの変異MTは重金属結合量が減少したが、結合量が1原子増えたものが得られた。
5)重金属結合量が増えた変位タンパク質について金属との解離度などを詳細に分析した。
6)ホモロジー分子モデルおよび関連する有機金属錯体の構造から置換可能なアミノ酸残基を検索し、11番目のアスパラギン酸と28番目のセリンが侯補として予測できた。
7)これらアミノ酸をシステインに置換し、大腸菌により生産し、金属結合量を調べたところ、変位型ヒトメタロチオネインは、カドミウムおよび亜鉛を1原子多く結合することが確認された。この様に、初めて重金属結合能を増加する天然メタロチオネインが構築できた。
8)毒素金属の中でもヒ素とメタロチオネインが結合できることを証明した。分光光学法、ICP-AES法およびMALDI-TOF-MSにより、ヒトメタロチオネイン1分子あたり6原子以上のヒ素と結合できることを初めて明らかにした。
9)DNAとの相互作用を調べるため、野生型および変異型メタロチオネインとプラスミドDNAとの結合を分析した結果、変異型と野生型では泳動距離に差があり、環状プラスミドDNAの量も多かった。
以上の研究により、初めて金属結合能を増加した天然メタロチオネインの作成に成功したこと、メタロチオネインは細胞内で種々の重金属(カドミウム、亜鉛、銅、ヒ素)と結合して解毒作用をするのみならず、核内においては金属と結合した形状でDNAと結合して、DNA結合タンパク質の機能をしていることが示唆された。

  • 研究成果

    (24件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (24件)

  • [文献書誌] S.-H.Hong: "Molecular design of novel metal-binding oligomeric human metallothioneins"Applied Microbiology and Biotechnology. 54. 84-89 (2000)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] S.-H.Hong: "High yield expression and single step purification of human thionein/metallothionein"Protein Expression and Purification. 21(1). 243-250 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] Y.Murooka: "Genetic design of stable metal-binding biomolecules, oligomeric metallothioneins"Biocatalysis and Biotransformation. 19. 399-412 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] N.Yoshida, et al.: "Bacterium-based heavy metal biosorbents : Enhanced uptake of cadmium by E. coli expressing a metallothionein fused to β-galactosidase"Bio Techniques. 32(3). 551-558 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] M.Toyama, et al.: "Alteration of substrate specificity of cholesterol oxidase from Streptomyces sp. by site-directed mutagenesis"Protein Engineering. 15(6). 477-483 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] M.Toyama, et al.: "Interactions of arsenic with human metallothionein-2"Journal of Biochemistry. 132. 217-221 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] Y.Murooka, et al.: "Variation of the amino acid content of Arabidopsis seeds by expressing soybean aspartate aminotransferase gene"Journal of Bioscience and Bioengneering. 94(3). 225-230 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] R.Sriprang, et al.: "A novel bioremediation system for heavy metals using the symbiosis between leguminous plant and genetically engineered rhizobia"Journal of Biotechnology. 99. 279-293 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] N.Yoshida, et al.: "Bactenum-based heavy metal biosorbents : Enhanced uptake of cadmium by E. coli expressing a metallothionein fused to β-galactosidase"Bio Techniques. 32(3). 551-558 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] S.Kawamoto, et al.: "Toward elucidating the full spectrum of mite allergens -state of the art"Journal of Bioscience and Bioengneering. 94(4). 285-298 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] R.Sriprang, et al.: "Enhanced accumulation of Cd^<2+> by a Mesorhizobium sp. transformed with a gene from Arabidopsis thaliana coding for phytochelatin synthase"Applied Environmental Microbiology. 69(3)(in press). (2003)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] 鈴木孝仁編集: "微生物の資材化:研究の最前線"ソフトサイエンス社. 364 (2000)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] S.Nishikawa, Y.Murooka: "Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. Vol.18"Intercept, Andover, England (ed. S. E. Harding). 149-170 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] 室岡義勝(編集委員長): "生物工学実験書(改訂版)"日本生物工学会編、培風館. 1-480 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] Y.Murooka, et al.: "Biotechnology in Sustainable Biodiversity and Food Security"Science Publisher Inc., Plymouth, UK(ed. B. N. Prasad). 31-39 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] S.-H.Hong, M.Gohya, H.Ono, H.Murakami, M.Yamashita, N.Hirayama, and Y.Murooka: "Molecular design of novel metal-binding oligomeric human metallothioneins"Appl. Microbiol. Biotechnol.. 54. 84-89 (2000)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] S.-H.Hong, M.Toyama, W.Maret, and Y.Murooka: "High yield expression and single step purification of human thionein/metallothionein"Protein Expr. Purif.. 21(1). 243-250 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] Y.Murooka, M.Toyama, S.-H.Hong, M.Gohya, H.Ono, M.Yamashita, and N.Hirayama: "Genetic design of stable metal-binding biomolecules, oligomeric metallothioneins"Biocatalysis and Biotransformation. 19. 399-412 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] N.Yoshida, T.Kato, T.Yoshida, K.Ogawa, M.Yamashita, and Y.Murooka: "Bacterium-based heavy metal biosorbents : Enhanced uptake of cadmium by E. coli expressing a metallothionein fused to β-galactosidase"BioTechniques. 32(3). 551-558 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] Toyama,M., Yamashita,M., Yoneda,M., Zaborowski,A., Nagato,M., Ono,H., Hirayama,N., and Murooka,Y.: "Alteration of substrate specificity of cholesterol oxidase from Streptomyces sp. by site-directed mutagenesis"Protein Eng.. 15(6). 477-483 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] M.Toyama, M.Yamashita, N.Hirayama, and Y.Murooka: "Interactions of arsenic with human metallothionein-2"J. Biochem.. 132. 217-221 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] R.Sriprang, M.Hayashi, M.Yamashita, H.Ono, K.Saeki, and Y.Murooka: "A novel bioremediation system for heavy metals using the symbiosis between leguminous plant and genetically engineered rhizobia"J. Biotechnol.. 99. 279-293 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] R.Sriprang, M.Hayashi, H.Ono, M.Takagi, K.Hirata, and Y.Murooka: "Enhanced accumulation of Cd^<2+> by a Mesorhizobium sp. transformed with a gene from Arabidopsis thaliana coding for phytochelatin synthase"Appl. Environ. Microbiol.. 69(3), (in press). (2003)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] S.Kawamoto, T.Aki, M.Yamashita, A.Tategaki, T.Fujimura, S.Tsuboi, T.Katsutani, O.Suzuki, S.Shigeta, Y.Murooka, and K.Ono: "Toward elucidating the full spectrum of mite allergens-state of the art"J. Biosci. Bioeng.. 94(4). 285-298 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より

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公開日: 2004-04-14  

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