タンパク質工学的手法による酵素の有機溶媒安定性の解明と有機溶媒に安定な酵素の開発

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11450317
• 研究機関: 大阪府立大学
• 研究代表者: 石川 治男 大阪府立大学, 大学院・工学研究科, 教授 (00081349)
• 研究分担者: 荻野 博康 大阪府立大学, 大学院・工学研究科, 助手 (80233443)
• キーワード: 有機溶媒耐性酵素 / リパーゼ / プロテアーゼ / 有機溶媒耐性微生物 / Pseudomonas aeruginosa

研究概要

一般に酵素は水溶液中で反応を行うが、基質が水難溶性の場合や、加水分解酵素を用いて加水分解の逆反応である合成反応を行う場合には、反応溶液中に有機溶媒を添加することが望ましい。しかしながら、一般に酵素は有機溶媒存在下では不安定であり、容易に失活する。そのため、有機溶媒存在下で安定な酵素が求められている。申請者らは、先に、有機溶媒に安定なリパーゼを産生する有機溶媒耐性微生物Pseudomonas aeruginosa LST-03株の取得に成功している。本研究では、P.aeruginosa LST-03株が産生する有機溶媒に安定なLST-03リパーゼの有機溶媒安定性をタンパク質工学的手法により解明することを目的とする。
本年度は、P.aeruginosa LST-03株の染色体DNAからショットガン法によりリパーゼ遺伝子のクローニングを行った。リパーゼ活性を有する8個の形質転換体が得られ、5.3、3.1、3.1、6.3、5.3、6.3、5.3、および10.2キロ塩基対のLST-03株の染色体DNA断片がクローニングされていることがわかった。それらのDNA断片を解析したところ、異なる4つのリパーゼ遺伝子(lip3、lip5、lip6、およびlip8)がクローニングされていることがわかった。このことからLST-03株は少なくとも4種以上のリパーゼ遺伝子を有していることがわかった。また、リパーゼ遺伝子を含むDNA断片の塩基配列を決定した。しかしながら、これらの遺伝子配列には、有機溶媒に安定なLST-03リパーゼのN-末端アミノ酸配列に相当する配列は見出されなかった。

研究成果

• [文献書誌] H.Ogino et al.: "Purification and Characterization of Organic Solvent-Stable Lipase from Organic Solvent-Tolerant Pseudomonas aeruginosa LST-03"Biochemical Engineering Journal. 89・5. 451-457 (2000)
• [文献書誌] H.Ogino et al.: "Cloning and Sequencing of a Gene of Organic Solvent-Stable Protease Secreted from Pseudomonas aeruginosa PST-01 and Its Expression in Escherichia coli"Biochemical Engineering Journal. 5・3. 191-200 (2000)
• [文献書誌] H.Ogino et al.: "The Synthetic Rate of Dipeptide Catalyzed by Organic Solvent-Stable Protease from Pseudomonas aeruginosa PST-01 in the Presence of Water-Soluble Organic Solvents"Biochemical Engineering Journal. 5・3. 219-233 (2000)
• [文献書誌] H.Ogino et al.: "Role of Intermolecular Disulfide Bonds of the Organic Solvent-Stable PST-01 Protease in the Organic Solvent-Stability"Applied and Environmental Microbiology. 67・2. 942-947 (2001)
• [文献書誌] H.Ogino and H.Ishikawa: "Enzymes Which are Stable in the Presence of Organic Solvents"Journal of Bioscience and Bioengineering. 91・2. 109-116 (2001)
• [文献書誌] T.Ito et al.: "Lipase Production in Two Step Fed-Batch Culture of an Organic Solvent Tolerant Strain, Pseudomonas aeruginosa LST-03"Journal of Bioscience and Bioengineering. (in press).