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脱窒能を有する光合成細菌Rhodobacter sphaeroides f.sp.denitrificans は、グラム陰性紅色非硫黄光合成細菌緑色変異株で、光合成生物の中で脱窒能を持つことが最初に確認された細菌である。この細菌は呼吸基質としてO_2、NO^+_3、N_2O、dimethyl sulfoxide (DMS0)等を利用できる多様性を有し、また光合成によっても生育に必要なエネルギーを獲得できる。本菌を1000mlスクリューキャップ付きガラスビンで嫌気的に光条件下25℃で24〜30時間対数増殖期終期まで培養し、硫安分画、陰イオンクロマトグラィー、ゲルろ過クロマトグラフィー・ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによってN_2O還元酵素を精製した。精製した酵素をNative-PAGEによってその純度を確認した。またICP/AESを用いて本酵素の金属含量を調べ、その結果酵素1分子あたり4原子の銅を含み、亜鉛、ニッケルは含まないことを明らかにした。金属の存在状態を調べるため、紫外可視吸収スペクトルを測定したところ、Ps.Stutzeri のN_2O 還元酵素とは異なる挙動を示した。精製したN_2O還元酵素についてSDS-PAGEを行った後、PVDF膜にエレクトロブロッティングし、アミノ酸のシークエンスの一部を解析した。その結果、今までに遺伝子配列が解明されているPs.Stutzeri、Ps.aeruginosa、A.eutrophus やPa.Denitrificans のN_2O還元酵素のN末端付近のアミノ酸配列と高い相同性があることが判明した。次にNO還元酵素の新規な活性検出法を自発的NO発生試薬を利用して構築した。これを利用して膜酵素であるNO還元酵素の可溶化法を検討し、NO還元酵素を精製する。
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