好塩性・好熱性酵素サーモライシンの活性発現機構の分子論,蛋白質工学および応用

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11460040
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 井上 國世 京都大学, 大学院・農学研究科, 教授 (10223249)
• 研究分担者: 滝田 禎亮 京都大学, 大学院・農学研究科, 助手 (70263126) ; 榊 利之 京都大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (70293909)
• キーワード: 金属プロテアーゼ / サーモライシン / 好熱性酵素 / 好塩性酵素 / 蛋白質工学 / アスパルテーム / 酵素活性 / 塩類

研究概要

我々は、好熱性プロテイナーゼであるサーモライシン(TLN)の活性が高濃度の塩類の添加につれて指数関数的に増大し、飽和濃度のNaClの存在下に数十倍も増大することを報告した。さらに、高濃度の塩類の存在下に安定性も増大することを見出し、TLNは好塩性酵素であることを示した。本研究では、チロシン残基、リジン残基、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基を対象にして、化学修飾と部位特異的変位導入法により、電荷を付加、消去、反転させることを試み、活性と安定性に及ぼす効果を検討した。チロシン残基のニトロ化やアミノ化、リジン残基のTNBSによる修飾およびマレイミド化、またリジン残基にポリエチレングリコール(PEG)を付加した。一方、6個のセリン残基をアスパラギン酸に変換した。このような修飾と変異導入により、TLNの高度な好塩性が分子表面の静電的環境に依存することを見出した。PEGの付加により酵素活性が顕著に上昇した。これはPEGの付加により、またPEGに対する水和によりTLNの自由度が抑制されることに起因すると判断した。すなわち、あたかも高塩濃度存在下で、TLNの分子表面が静電場を失い、しかも自由度が抑制された状態に類似している。部位特異的導入により、活性部位S2サブサイトに存在するTrp-115を種々のアミノ酸残基に変換した。チロシンとフェニルアラニンに変換した変異型TLNでは、天然型酵素に比べ、活性がわずかに低下するものの80%以上の残存活性を維持した。一方、これら芳香族アミノ酸以外のアミノ酸に変換した変異酵素では全く活性を消失した。このことから、Trp-115は活性発現に重要な寄与をすることが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] K.Morimoto: "Method for the preparation of Bispecific F(ab') 2μ fragments of mouse monoclonal antibody…"J. Immunol Methods. 224・1. 43-50 (1999)
• [文献書誌] T.Sakaki: "Enzymaric properties of human 25-hydroxy vitamin D3 12-hydroxylase expressed Escherichia coli"Eur.J. Biochem.. 259. 731-738 (1999)
• [文献書誌] T.Sakai: "Metabolic studies using recombinant E. coli cells producing rat mitochondrial CYP24"Eur. J. Biochem.. 262. 43-48 (1999)
• [文献書誌] N.Sawada: "Enzymatic properties of human 25 hydroxy vitamin 12-hydroxylase"Eur. J. Biochem.. 265. 950-956 (1999)
• [文献書誌] S.Kondo: "Electrostatic interaction between cytochrome P450 and NADPH-P450 reductase"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 257. 273-278 (1999)
• [文献書誌] K.Inouye: "Inhibitory effects of vitamin A and vitamin K on rat cytochrome P450 1A1-dependent・・"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 262. 565-569 (1999)
• [文献書誌] H.Oneda: "Refolding and recovery of recombinant human matrix metalloproteinase 7 .."J. Biochem.. 126. 905-911 (1999)
• [文献書誌] A.Tanaka: "Guanidine hydrochloride-induced denaturation of Pseudomonas cepacia lipase"J. Biochem.. 126. 382-386 (1999)
• [文献書誌] Y.Yamasaki: "Separation of amino acids and peptides by high-performance liquid chromatography"J. Liq. Chrom. Rel. Technol.. 22・13. 1965-1974 (1999)
• [文献書誌] S.Kitanaka: "No enzyme activity of 25-hydroxyvitamin D3 12-hydroxylase gene product in・・・"J. Clin Endocrinol. Metab.. 84. 4111-4117 (1999)
• [文献書誌] K.Adachi: "Relationship between the activity of glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase in hair follicles"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 63. 2219-2221 (1999)
• [文献書誌] M.Kubo: "Mechanism of thermostability in thermolysin Analysis of subsite S2 mutant"Lett. Appl. Microbiol.. 28. 431-434 (1999)
• [文献書誌] T.Takita: "Lysyl-tRNA synthetase of Bacillus stearo-thermophilus.Molecular cloning and expression."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・2. 432-437 (2000)
• [文献書誌] S.Jinno: "Total synthesis of a natural antioxidant and structure-activity relationships."Chem.Pharm.Bull.. 47・9. 1276-1283 (1999)
• [文献書誌] S.Jinno: "Total synthesis of a antioxidant isolated from yeast via palladium-catalyzed."Bioorg.Med.Chem.Lett.. 9. 1029-1032 (1999)
• [文献書誌] 井上 國世: "タンパク質の熱安定性の上限はどこにあるか?"化学と生物. 37・11. 738-739 (1999)
• [文献書誌] 井上 國世: "好熱性プロテイナーゼ、サーモライシンの好塩性と塩に依存する活性化の酵素化学"科学と工業. 73・11. 527-532 (1999)
• [文献書誌] 井上 國世: "酵素化学的および物理化学的手法を用いる大豆"大豆たん白質研究. 2. 20-27 (1999)
• [文献書誌] M. Okamoto: "Molecular Steroidogenesis"Universal Acadeny Press, Inc., Tokyo. 442 (2000)