好塩性・好熱性酵素サーモライシンの活性発現機構の分子論、蛋白質工学および応用

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11460040
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• 研究分担者: 滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助手 (70263126) ; 榊 利之 京都大学, 農学研究科, 助教授 (70293909)
• キーワード: 金属プロテイナーゼ / サーモライシン / 亜鉛酵素 / アスパルテーム / マトリライシン / 部位特異的変異導入 / 酵素活性 / 酵素の安定性

研究概要

サーモライシン(TLN)産生菌のニトロソグアニジン処理により、2種の変異酵素(T1,T2)を得た。T1では、TLNのVal-140がAlaに、T2ではAla-73がValに変換されていた。T1はTLNに比べ、カゼイン分解活性が150%に増大したが、低分子ペプチド分解活性は35%に減少した。一方、T2ではカゼイン活性は10%に減少したのに対し、FAGLA活性は1200%に増大した。Val-140,Ala-73に対して、部位特異的変異導入を試みた。A73Vは人工甘味剤前胚体Z-Asp-Phe-OMe合成活性がTLNに比べて10倍増大し、ペプチド合成における有用性が示された。Ala-73とVal-140は、基質特異性の決定に大きい影響をもつことが示され、Ala-73へのかさ高い側鎖の導入により、蛋白質分解活性を抑制し、高いペプチド特異性を持つ酵素を創出できた。TLNの活性部位亜鉛をコバルトに置換した。本酵素の安定性はTLNと差異がないが、活性は5倍増大した。一方、遷移状態アナログによる阻害活性も5倍増大した。Co-TLNでは遷移状態の安定化により、活性が増大すると考えられた。Co-TLNはTLNと同様に高濃度の塩により顕著な活性化をうけた。塩による活性化は、Co-置換による活性化と相乗的であり、4M NaCl存在下のCo-TLNの活性はTLNより70倍も高い。ヒトマトリライシン(MLN)とTLNを比較した。MLN活性は塩濃度に依存して指数関数的に増大したが、TLNでは活性化がkcatのみに依存するのに対し、MLNではKmのみに依存した。MLNは高い熱安定性を示した(Tm=85℃)。4M尿素では完全失活したモルテングロビュル構造を取ることが示され、TLN活性ドメインと類似性を持つことが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] H.Oneda and K.Inouye: "Interaction of human matrix metallopnoteinase 7 (matrilysin) with the inhibitors, thiorphan…"J.Biochem. 129. 429-435 (2001)
• [文献書誌] K.Inouye and S.Ohnaka: "Pepsin digestion of a mouse monoclonal antibody of I9G1 class formed F(ab')2…"J.Biochem.Biophys Methods. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] S.Okumura,S.Akao,K.Inouye 他2名: "Screening of the Bacillus thuringiensis Cry1AC δ - endotoxin on the…"J.Biochem.Biophys.Methods. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] K.Inouye,S.Kondo,M.Yamamura 他2名: "Inhibitory effects of detergents on rat CYP1A1 - dependent monooxygenase."Biochem.Biophys.Res.Commun.. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] K.Inouye,T.mizokawa,A.Saito 他3名: "Biphasic Kinetic behavior of rat Cytochrome P4501A1 - dependent monooxygenation…"Biochim.Biophys.Acta. 1481・2. 265-272 (2000)
• [文献書誌] T.Sakaki and K.Inouye: "Practical application of mammalian cytochrome P450"J.Biosci.Biotechnol.. 90. 583-590 (2000)
• [文献書誌] K.Inouye,A.Saito,M.Orita 他3名: "Inhibitory effects of 1, 4 - naphthoquinones on rat cytochrome P4501A1 - dependent…"J.Biochem.. 127・6. 1041-1046 (2000)
• [文献書誌] H.Oneda and K.Inouye: "Effects of dimethyl sulfoxide, temperature, and sodium chloride on the activity…"J.Biochem.. 128・5. 785-791 (2000)
• [文献書誌] N.Sawada,T.Sakaki,K.Inouye 他1名: "metabolism of vitamin D3 by human CYP27A1"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 273・3. 977-984 (2000)
• [文献書誌] K.Inouye,H.Tanaka,and H.Oneda: "States of tryptophyl residues and stability of recombinant human matrix…"J.Biochem.. 128・3. 363-369 (2000)
• [文献書誌] T.Takita,N.Shimizu,K.Inouye 他7名: "Lysyl tRNA synthetase of Bacillus stearothermophilus."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・2. 432-437 (2000)
• [文献書誌] K.hayashi,T.Sakaki,K.Inouye 他2名: "Coexpression of genetically engineered fused enzymes between yeast NAPPH - P450 reductase"Anch.Biochem.Biophys.. 381・1. 164-170 (2000)
• [文献書誌] K.Monimoto and K.Inouye: "Application of bispecific F (a b')2μ fragments prepared from IgMS against CEA…"Clin.Chem.. 46. 1492-1493 (2000)
• [文献書誌] T.Sakaki,N.Sawada,K.Kamai,K.Inouye 他4名: "Dual metabolic pathways of 25-hydroxy vitamin D3 catalyzed by human CYP24"Eur J. Biochem.. 267. 6158-6165 (2000)
• [文献書誌] 榊利之,井上國世: "ビタミンD24-水酸化酵素の生理作用"季刊 腎と骨代謝. 13・2. 129-135 (2000)
• [文献書誌] 井上國世,滝田禎亮,永井宏平: "プロテアーゼによる分離大豆たん白質の凝集反応の考察"大豆たん白質研究. 3. 22-28 (2000)
• [文献書誌] K.Inouye and T.Sakaki: "Enzymatic studies on the key enzymes of vitamin D metabolism."biotechnol.Ann.Rev.. 7. 179-194 (2001)
• [文献書誌] K.Inouye: "Handbook of Food Enzymology (J.R.Whitaker 他3名 編)"Mercel Dekker(印刷中). (2001)
• [文献書誌] N.Sawada,T.Sakaki,K.Inouye 他3名: "Molecular Steroidogenesis (M.Okamoto,Y.Ishimura and H.Nawata 編)"Universal Academy press, Tokyo. 442 (2000)
• [文献書誌] T.Sakaki,N.Sawada,K.Inouye 他2名: "Molecular Steroidogenesis (M,Okamoto,Y.Ishimura, and H.Nawata 編)"Universal Academy Press, Tokyo. 442 (2000)
• [文献書誌] 井上國世: "動物細胞工学ハンドブック"朝倉書店. 362 (2000)
• [文献書誌] 井上國世: "酵素ハンドブック(第3版)"朝倉書店(印刷中). (2001)