芳香環オキシゲナーゼ遺伝子シャフリングによる新規な分解代謝系の構築

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11460048
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 古川 謙介 九州大学, 農学部, 教授 (90221556)
• 研究分担者: 後藤 正利 九州大学, 農学部, 助手 (90274521) ; 吉野 貞蔵 九州大学, 農学部, 助教授 (80117291)
• キーワード: オキシゲナーゼ / ハイブリッド酵素 / 遺伝子シャフリング / 基質特異性 / 分解遺伝子 / PCB / 芳香族炭化水素代謝 / ジベンゾフラン

研究概要

微生物起源の芳香族炭化水素の分解遺伝子クラスターの構造と機能は、微生物の物質変換機能の進化的側面を反映している。ビフェニルオキシゲナーゼ、トルエンオキシゲナーゼなどの芳香環初期酸素添加酵素はマルチコンポーネント酵素で、4つのサブユニットから構成される。即ち、分子状酸素を活性化し、芳香環基質に添加する末端オキシゲナーゼ(大小サブユニットより構成)とNADHからの電子伝達系に関与するフェレドキシンおよび還元酵素から成る。本研究では遺伝子間でサブユニットタンパク質の相互置換、機能ドメインの相互置換、およびDNAシャフリングの手法を用いて新規な機能をもつハイブリッドオキシゲナーゼを構築する。
(i)PCB分解能の異なる5種類の分解菌から基質特異性に関与するbphA1遺伝子(末端オキシゲナーゼの大サブユニット)をPCRにより増幅し、Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707株由来の他のオキシゲナーゼサブユニット遺伝子クラスター(bpbA2/bphA3/bphA4)の上流に挿入、大腸菌で発現させた。その結果、構築したハイブリッド酵素の基質特異性はbphA1由来の親株の酵素に類似していた。即ち、ビフェニルジオキシゲナーゼの基質特異性はBphA1に大きく依存することが明らかとなった。
(ii)Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707のbphA1遺伝子は基質特異性に関与することからランダムオリゴプライマー(ヘキサマー)を用いてbphA1遺伝子にランダムに変異を導入した。これらの変異bphA1をbphA2/bphA3/bphA4の上流に繋ぎ大腸菌で発現させた。これらのクローンから、野生酵素が元来アタックできないジベンゾフランに活性を示す数株を取得した。

研究成果

• [文献書誌] Tsuda.,M.,Tan,H-M,Nishi,A.,and Furukawa,K.: "Mobile vatablic genes in bacteria."J.Biosci.Bioeng.. 87・4. 401-410 (1999)
• [文献書誌] Suenaga,H.,Nishi,A.,Watanabe,T.,Sakai.M.and Furukawa,K.: "Engineering a hybrid pseudomonad aquired 3,4 dioxygenase activity for polycholorinated biphenyls."J.Biosc.Bioeng.. 87・4. 430-435 (1999)
• [文献書誌] Nishi,A.,Tominaga,K., and Furukawa,K.: "A 90 kilobase conjutgative chromosomal element coding for biphenyl and salicylate catebolism in Pseudomonas putida KF715."J.Beacteriol.. (in press). (2000)
• [文献書誌] 古川謙介、陶山明子、李泰鎬: "微生物による有機塩素化合物の分解"環境科学. 12. 449-461 (1999)