芳香環オキシゲナーゼ遺伝子シャフリングによる新規な分解代謝系の構築

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11460048
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 古川 謙介 九州大学, 大学院・農学研究院, 教授 (90221556)
• 研究分担者: 後藤 正利 九州大学, 大学院・農学研究院, 助手 (90274521) ; 吉野 貞蔵 九州大学, 大学院・農学研究院, 助教授 (80117291)
• キーワード: ダイオキシン / ジオキシゲナーゼ / Pseudomonas / ハイブリッド酵素 / アルキルベンゼン / DNAシャフリング / PCB

研究概要

微生物起源の芳香環の初期酸素添加に関与するジオキシゲナーゼはマルチコンポーネント酵素で、3つ乃至4つのサブユニットから構成されている。本研究ではこれまでに鉄・硫黄タンパク質である大サブユニットがジオキシゲナーゼの基質特異性に関与していることを明らかにした。本年度は以下の研究成果が得られた。
(1)本年度は昨年度に引き続き、Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707株のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットであるbphA1遺伝子にランダムヘキサマーを用いて取得した諸種の変異ジオキシゲナーゼを大腸菌で発現させ、改変ジオキシゲナーゼの機能を検討した。その結果、昨年取得したジベンゾフランを酸化分解する新規な酵素遺伝子を更に改変することにより、野生株酵素が全く分解できないダイオキシンをも分解できる酵素を新たに取得できた。ついで、この遺伝子の解析からダイオキシン分解に関与するアミノ酸を推定した。
(2)ビフェニル資化菌である上記P.pseudoalcaligenes KF707株とBurkholderia cepacia LB400株はともにPCBを分解するがその分解特性は非常に異なっており、前者は塩素数1〜3のPCBしか分解できないのに対し、後者は4〜5のPCBをも分解できる。しかし、その分解遺伝子クラスターの構造および個々の遺伝子の塩基配列は極めて類似している。両菌株のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットであるbphA1に対してDNAシャフリングを行い取得したキメラジオキシゲナーゼから、野生株の酵素が全くアタックできないベンゼンとトルエンおよび諸種のアルキルベンゼンを速やかに分解するキメラジオキシゲナーゼがスクリーニングされた。このキメラBphA1の解析から4つのアミノ酸がLB400株から由来していた。

研究成果

• [文献書誌] Nishi,A.,Tominaga,K.and Furukawa,K.: "A 90 kilobase conjugative chromosomal element coding for biphenyl and salicylate in Pseudomonas putida KF715"J.Bacteriol.. 182. 1949-1955 (2000)
• [文献書誌] Furukawa,K.: "Engineering dioxygenases fro efficient degradation of environmental pollutants"Curr.Topics Biotechnol.. 11. 244-249 (2000)
• [文献書誌] Watanabe,T.,Inoue,R.,Kimura,N.and Furukawa,K.: "Versatile transcription of biphenyl catabolic bph operon in Pseudomonas pseudoalcalinese KF707"J.Biol.Chem.. 275・40. 31016-31023 (2000)
• [文献書誌] 古川謙介,陶山明子: "難分解性有機ハロゲン化合物の微生物分解の現状と展望"生物と化学. 38. 390-397 (2000)
• [文献書誌] 末永光,古川謙介: "微生物によるPCBの分解"ファインケミカル. 29. 5-16 (2000)