植物病原菌感染過程における植物毒素の果たす機能の経時的解析法の確立

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11460052
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 及川 英秋 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (00185175)
• 研究分担者: 古市 尚高 新潟大学, 農学部, 助教授 (50238664)
• キーワード: 植物病原菌 / 植物毒素 / ソラナピロン / アルタナル酸

研究概要

昨年に引き続きジャガイモ夏疫病菌のゲノムライブラリーを用いて、ソラナピロン生合成遺伝子クラスターの探索を行った。得られたコスミドには予想される還元型ポリケタイド合成酵素遺伝子とその近傍にDiels-Alder型環化を触媒すると予想される酸化酵素遺伝子が見出すことに成功した。今後これら遺伝子を異種糸状菌で発現させ、その機能を確認する予定である。
病原菌由来宿主特異的、非特異的毒素、アルタナル酸(AA)およびソラナピロン(SP)のジャガイモ葉を用いた生物検定を行ったところ、AAでは投与後24hで0.25mMと低濃度から濃度依存的に壊死が観察された。一方SPは24hでは顕著な活性は見られず、5日後になり壊死が確認された。ジャガイモ細胞膜タンパク質キナーゼに対する影響に関し詳細な検討を加えた。大腸菌にてジャガイモCa^<2+>依存型タンパク質キナーゼ遺伝子を発現させ、得られた精製キナーゼを用いて、上記毒素の作用を解析した。その結果、Ca^<2+>存在下AAは活性を53%阻害するが、Ca^<2+>およびMg^<2+>共存下ではAA処理により25%の促進が観察された。同様の効果はサプレッサーの処理によっても観察された。既にサプレッサーおよびAAは過敏感細胞死(HR)を抑制することが知られているが、これらの結果はサプレッサーとAAのキナーゼに対する作用と類似しており、キナーゼを介した制御によりHRの阻害に関与している可能性を示唆した。ソラナビロンの場合もキナーゼに対する作用はCa^<2+>およびMg^<2+>存在下で影響を受け、Ca^<2+>存在下活性を38%促進するが、Ca^<2+>およびMg^<2+>共存下では71%の促進が観察された。
このほかツユクサを犯す病原菌から毒素生合成に関わる酵素遺伝子を取得し、大腸菌での過剰発現に成功した。マクロフォミン酸合成酵素と名付けた本酵素の諸性質、反応機構について調べた。その結果この酵素はMg^<2+>依存性のオキザロ酢酸脱炭酸酵素であり、2-ピロンと反応して合計5段階の変換反応を触媒する興味深い酵素であることが判明した。

研究成果

• [文献書誌] A.Hassan: "Fusion Protein of Calcium-dependent Protein Kinase Gene from Potato Interacts with elicitor andsuppressor"Plant-Microbe Interaction, Japan. 11・1. 27-30 (2001)
• [文献書誌] K.Watanabe: "Reaction Mechanism of the Macrophomate Synthase : Experimental Evidence on Intermediacy of a Bicyclic Compound"Tetrahedron Lett.. 41・9. 1443-1446 (2000)
• [文献書誌] K.Watanabe: "Macrophomate Synthase : Characterization, Sequence, and Expression in Escherichia coli of the Novel Enzyme"J.Biochem.. 127・3. 467-473 (2000)
• [文献書誌] H.Oikawa: "Potent Inhibition of Macrophomate Synthase by Reaction Intermediate Analogs"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・11. 2368-2379 (2000)
• [文献書誌] K.Watanabe: "Detailed Reaction Mechanism of Macrophomate Synthase : Extraordinary Enzyme Catalyzing Five-step Transformation"J.Biol.Chem.. 275・49. 38393-38401 (2000)
• [文献書誌] K.Watanabe: "Substrate Diversity of Macrophomate Synthase Catalyzing Unusual Multistep Transformation"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・3. 530-538 (2000)