L型Caチャネルリン酸化制御に関する分子的責任部位探索

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11470011
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 山岡 薫 広島大学, 医学部, 助教授 (10200586)
• 研究分担者: 結城 常譜 広島大学, 医学部, 助手 (90294561)
• キーワード: L型Caチャネル / マグネシウム / リン酸化 / カエル / モルモット / 温度

研究概要

L型Caチャネル(LCC)の機能発現にはチャネル蛋白以外にも多くの物質が関与していることは、遺伝子を細胞に発現させたのみではリン酸化を含めいろいろな制御機構が失われていることが多く報告されていることで窺える。我々は既に細胞内Mg^<2+>によるチャネルのブロックがリン酸化によって失われることにより、チャネル活動の増大が生じることを示した。本研究はこのリン酸化制御に関与する細胞内Mgの結合あるいは作用部位の探索を目的として計画された。その結果、チャネル機能の再現において、上記細胞内Mg^<2+>制御機構は発現されたチャネルにおいては存在しなかったこと、リン酸化制御機構においても十分な反応が見られなかったこと、モルモットとカエルでは温度依存性に細胞内Mg^<2+>に対する反応性が異なることなどが新たにわかった。これらのことはMg^<2+>結合あるいは作用部位がチャネル蛋白自身以外に求めねばならないことを示唆し、今後この研究の更なる継続の必要性を示した。以下具体的結果を示す。1.モルモットの心室筋においては室温では細胞内低Mgによる電流増大現象がはっきりと観察されなかったところ、温度が28℃以上でMgの効果が見られた。この現象は非可逆的であり、そのQ10は通常の熱力学反応ではないことを示した。すなわち脂質膜や他の蛋白との相互作用、構造変化を含めた複雑な機構の存在が示唆される2.カエル心室筋のLCCα1サブユニットの遺伝子を全長にわたり同定した。この遺伝子はウサギ、ラットのLCCα1サブユニットとアミノ酸レベルで80%の相同性を示した。またそのL型Caチャネルのサブユニットを校正する他の分子、α_<2_δ>、β_<2C>においても同定した。それらのサブユニットと共にBHK細胞に共発現させることでチャネルの機能的活動が観察された。すなわちα_<2_δ>、β_<2C>の存在は機能発現に必須であることを示した。3.BHK細胞に再現されたカエルL型Caチャネルは細胞内を低Mg^<2+>にすること(10^<-5>M以下)で急速なチャネル機能の消失が見られた。すなわち細胞内Mg^<2+>+は成熟細胞とは異なり機能の維持に関しての役割が重要であること、またチャネル制御機能の十分な再現が成されないことから、これらの制御には未知のシステムの存在が必要であることを強く示した。

研究成果

• [文献書誌] Yakehiro M, Yamaoka K et al.: "Novel mechanism of blocking axonal Na^+ channels by three macrocyclic polyamine analogues and two spider toxins"Br J Pharmacol. 132. 63-72 (2001)
• [文献書誌] Kinoshita E, Maejima H, Yamaoka K et al.: "Novel Wasp Toxin Discriminates between Neuronal and Cardiac Sodium Channels"Mol Pharmacol. 59. 1457-1463 (2001)
• [文献書誌] Yuki T, Yamaoka K, Yakehiro M, Seyama I: "State dependent action of grayanotoxin I on Na channels in frog ventricular myocytes"J Physiol (Lond). 534. 777-790 (2001)
• [文献書誌] Kimura T, Yamaoka K et al.: "Novel site on sodium channel alpha subunit responsible for the differential sensitivity of grayanotoxin in skeletal and cardiac muscle"Mol Pharmacol. 60. 865-872 (2001)
• [文献書誌] Yamaoka K, Yuki T, Kawase K, Munemori M, Seyama I: "Temperature-sensitive intracellular Mg^<2+> block of L-type Ca channels in cardiac myocytes"Am J Physiol. 282. H1092-H1101 (2002)
• [文献書誌] Kawagoe H, Yamaoka K et al.: "Molecular basis for exaggerated sensitivity to mexilitine in the cardiac isoform of the fast Na channel"FEBS LETTERS. (in press).