組み換え糖鎖を有する完全リコンビナントプロテオグリカンの合成

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11470029
• 研究機関: 弘前大学
• 研究代表者: 遠藤 正彦 弘前大学, 医学部, 教授 (20004616)
• 研究分担者: 岩船 美都 弘前大学, 医学部, 助手 (80312487) ; 柿崎 育子 弘前大学, 医学部, 助手 (80302024) ; 高垣 啓一 弘前大学, 医学部, 助教授 (70163160)
• キーワード: プロテオグリカン / 糖鎖組み換え / 糖鎖工学 / リコンビナントプロテオグリカン / エンド型グリコシダーゼ / エンド-β-グルクロニダーゼ / ヒアルロニダーゼ / 糖鎖転移反応

研究概要

1.研究の背景と目的:第三の情報高分子、プロテオグリカンの糖鎖・グリコサミノグリカンには、様々な生理活性が組み込まれている。現在この高分子糖鎖は、有機化学的にも酵素的にも合成する技術は確立されていない。このため、遺伝子工学的に合成される糖鎖欠落のリコンビナントタンパク質への糖鎖の導入はできない。そこで、グリコシダーゼの加水分解反応の逆反応としての糖鎖転移反応を用いた糖鎖の組み換えと、その糖鎖のリコンビナントタンパク質への導入によるプロテオグリカンの酵素的完全合成法の確立を目指した。
2.研究実地の結果:1)糖鎖の組み換え及び組み換え糖鎖のタンパク質への導入のため、エンド型グリコシダーゼ(ヒアルロニダーゼ及び自ら発見したエンド-β-キシロシダーゼ)の糖鎖転移反応機序を明らかにした。2)天然のグリコサミノグリカン糖鎖を用いて、任意にデザインされた糖鎖配列通りに、ヒアルロニダーゼを用いて糖鎖組み換え技術を確立した。3)糖鎖組み換えの反応を実施するため、糖鎖の還元末端を2-アミノピリジンで蛍光標識する方法を確立した。4)組み換え糖鎖をタンパク質に導入するために有効なキャリヤーを、培養細胞の培地にキシロシル-(4-メチルウンベリフェロン)を添加して培養すると得られる糖鎖が最適であることを発見した。5)上記のキャリヤーに組み換え糖鎖を伸長させ、これをエンド-β-キシロシダーゼを用いてタンパク質に導入する方法を確立した。
3.研究成果:本研究は、天然の生理活性を有さないグリコサミノグリカン糖鎖をエンド型グリコシダーゼの糖鎖転移反応を用い、生理活性を有する糖鎖に組み換えて、これをタンパク質に導入するというプロテオグリカンの酵素的完全合成を世界に先駆けて成功した。本法により糖鎖工学の新しい道が拓かれたことを意味するものである。

研究成果

• [文献書誌] Higuchi, T., et al.: "Effects of ATP on regulation of galactosyltransferase-I activity responsible for synthesis of the linkage region between the core protein and glycosaminoglycan chains of proteoglycans"Biochem. Cell Biol.. 79. 159-164 (2001)
• [文献書誌] Takagaki, K., et al.: "Domain structure of chondroitin sulfate E octasaccharides binding to type V collagen"J. Biol. Chem.. (in press). (2002)
• [文献書誌] Ishido, K., et al.: "Enzymatic attachment of glycosaminoglycan chain to peptide using the sugar chain transfer reaction with endo-β-xylosidase"J. Biol. Chem.. (in press). (2002)
• [文献書誌] Takagaki, K., et al.: "The cleavage of the xylosyl serine linkage between a core peptide and glycosaminoglycna chain by cellulases"J. Biol. Chem.. (in press). (2002)
• [文献書誌] Takagaki, K., et al.: "Carriers for enzymatic attachment of glycosaminoglycan chains to peptide"Biochem. Biophys. Res. Commun. (in press). (2002)