研究課題/領域番号 |
11470120
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研究種目 |
基盤研究(B)
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研究機関 | 日本医科大学 |
研究代表者 |
長谷場 健 日本医科大学, 医学部, 講師 (50156329)
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研究分担者 |
山本 伊佐夫 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (30277917)
亀山 孝二 日本医科大学, 医学部, 助手 (60150736)
真下 啓子 日本医科大学, 医学部, 助手 (90113000)
黒沢 則夫 創価大学, 工学部, 講師 (30234602)
清水 昭夫 創価大学, 工学部, 助教授 (20235641)
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キーワード | Class I ADH / Class III ADH / Class III ADH遺伝子クローニング / マウス / アルコール代謝 / 肝ADH酵素量 / 活性・構造相関 / ADH大量発現系 |
研究概要 |
1.Class III ADH遺伝子(Adh3)knock out mouse作製のためのAdh3 cloning:BAC/129vJ mouse genome libraryからPCR法にて3種のAdh3 positive BAC clonesをscreeningし、insertを制限酵素処理後、pZEro-1 vectorにsubcloningして、4種のpositive clonesを選出した。現在、これらのcloneのinsertをmappingによって同定中。 2.Class IとClass III ADHのethanol pharmacokineticsにおける役割:mouseにEtOHを1-5g/kg投与して、肝ADH活性、Class IおよびClass III酵素量を測定し、pharmacokinetic parametersとの関係を統計学的に解析した結果、血中EtOH消失は投与量の増大に伴って、主にClass Iに依存したMichaelis-Menten kineticsからClass III依存のfirst-order kineticsに移行することが示唆された。 3.2量体ウマADH(Class I)と4量体酵母ADHを用いて、尿素存在下で活性-構造相関を検討したところ、ウマADHでは解離前に失活が、酵母ADHでは解離と共に失活が観察され、両者の活性-構造相関に相違がみられた。3次および2次構造の変化は両者とも解離後同時に観察された。 4.Class IとClass III ADHのcDNAをexpression vector pET3に入れ、E.coli BL21をtransformして、それらの発現をSDS-PAGEで検討した。Class IIIは菌体蛋白の約5%の発現が見られたが、Class Iでは微弱な発現しかなかったため、現在、その発現系を再検討中。
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