| 研究概要 |
本研究は、Cre-loxP系を応用することによりマウス心臓特異的にヒトIL-1α (hIL-1α) cDNAを過剰発現することにより、その発現に起因する心肥大の分子機構を解明することを最終目的とする。先ず、CAG (cytomegalovirus enhancer/chicken β-actin promoter)-loxP/EGFP (enhanced green fluorescent protein)-CAT (chloramphenicol acetyltransferase)/loxP-hIL-1α-IRES (internal ribosomal entry site)-lacZ transgene (CELIZ)を有するtransgenic (Tg)マウスを作製した。耳内部表面におけるEGFP発光の観察から、CELIZ高発現系統を最終的に2系統を得た。これら系統は全て健康的で繁殖は間題無かった。一方、心臓特異的にCre遺伝子を発現するTgマウス系統を作製するため、MHC (α-myosin heavy chain promoter)-Cre transgene (MHC-Cre)を構築し、これを持つTgマウスの作製を試みたが、何故か作製が失敗に帰した。この間、別の目的の実験から既にCreを骨格筋、心臓、脳、膵臓、腎臓等様々な臓器で発現するMNCE Tgマウス(Sato et al., Mol. Reprod. Dev. 60, 446-456, 2001)を作製していたので、このMNCEマウスとCELIZマウスとを掛け合わせることにより両者のtransgeneを有するdouble Tgマウスを作製した。このdouble Tgマウスでは、Creが骨格筋、心臓、脳、膵臓、腎臓等様々な臓器で発現するので、当該臓器でCELIZ transgene内のloxPで挟まれたEGFP/CAT配列が除去され、その結果、下流側のhIL-1α cDNA+IRES+lacZ遺伝子がCAG promoterの影響を受け、hIL-1α及びlacZが発現すると予想される。特に、心臓での、hIL-1αの発現は、心肥大を誘発することが期待される。double Tgマウスを生後8-10週目に剖検したところ、Creを発現する臓器(心臓を含む)には、全てlacZの発現があることがその基質であるX-Galによる組織化学的染色で判明した。また、RT-PCR法によりhIL-1α mRNAの発現を検索した結果、その発現が確認された。しかし、Northern blot解析では明確なhIL-1α mRNAに相当するバンドが得られなかったので、hIL-1α mRNAの発現は極めて低いと思われた。一方、心臓を病理組織解析に付したが、どのマウスも心肥大を示す所見は得られなかった。おそらく上述のように、hIL-1αの発現が未だ低いからと思われた。Cre-loxP系はtransgeneのloxP配列で挟まれる配列を飛ばすので、例えば、3-5 copyのtransgeneがintegrationされた場合、Creの作用で、single copyに減退してしまう。その結果、gene dosage効果で発現量が上がっていたものが、急激に低下する場合も考えられる。それが、今回のhIL-1α mRNA低発現を招いている可能性がある。IL-1αの効果は、その微量な発現でも組織・細胞に対し、影響を与えるものと考えており、その意味で、Cre-loxP系を用いた本実験系も有効かと考えられたが、心臓に関しては、微量ではIL-1αの効果がなく、多少の量が必要とされるのではと思われる。今では、Cre-loxP系の他にも例えば、テトラサイクリン誘導系IL-2 receptor-mediated gene expression induction系等のconditionalな遺伝子発現誘導系もあるので、目下、その系の導入・検討試みている段階である。
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