ヘムオキシゲナーゼ1欠損症の発見:血管内皮傷害病態の解明と遺伝子治療の基礎研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11470170
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 小泉 晶一 金沢大学, 医学部, 教授 (50019973)
• 研究分担者: 犀川 太 金沢大学, 医学部・附属病院, 講師 (60283107)
• キーワード: ヘムオキシゲナーゼ1 / Heme oxygenase-1 / 血管内皮障害 / ヘミン / Hemin / 溶血性貧血 / 酸化ストレス / 慢性炎症

研究概要

1)HO-1に対する単クローン抗体を用いた生検肝組織の免疫組織染色で患児肝にはHO-1が染色されなかった.
2)HO-1欠損患児と家族および正常対照者から末梢血単核球を分離し,B95-8培養上清を使用して,EBV芽球化細胞株(lymphoblastoid cell line,LCL)を作成した.これら,および以下の研究においては,細胞採取等はすべて患児の家族および正常対照者の同意のもとに実施した.患児末梢血細胞およびLCL細胞株を用いてウエスタンブロッティング法を実施したところ,HO-2蛋白は対照と同等に発現がみられたが,HO-1蛋白はヘミン,亜ヒ酸,カドミウムなどのストレス刺激後でも全く発現がみられなかった.
3)HO-1mRNAはRT-PCR法により,その発現が確認された.PCRプライマーの定量的最適条件を決定するためにシーケンスデテクションシステムを使用した.
4)患者LCL培養系にHO-1の基質であるヘミンを添加すると,患者細胞はヘミン濃度依存性に死滅した.
5)患児および両親のHO-1遺伝子解析から,母親ではエクソン2の欠損,父親ではエクソン3に2塩基欠損があることがわかり,患児はその重複へテロ接合体であることが知れた.
6)フローサイトメトリー法によるHO-1蛋白産生定量的評価:正常ヒト末梢血単核細胞をフローサイトメトリーで,単球,リンパ球に画分した.細胞刺激後,HO-1mRNA発現をRT-PCRで,HO-1蛋白発現をフローサイトメトリー法でみると,単球画分でHO-1発現が強く,リンパ球では逆に弱く,細胞系特異的なHO-1蛋白発現をフローサイトメトリー法でみると,単球画分でHO-1発現が強く,リンパ球では逆に弱く,細胞系特異的なHO-1発現調節機構の存在が示唆された.
7)正常HO-1遺伝子を含むレトロウイルスベクターの作成し,患児細胞株LCLへ遺伝子導入したところ,HO-1蛋白発現と機能の部分的正常化がみられた.

研究成果

• [文献書誌] Yachie A,et al.: "Oxidative stresses causes enhanced endothelial cell injury in human heme oxygenase-1 deficiency."J Clin Invest. 103. 129-135 (1999)
• [文献書誌] 太田和秀,谷内江明宏,小泉晶一: "尿細管上皮細胞におけるheme oxygenase-1機能の重要性"日本小児腎臓病学会誌. 12・2. 119-126 (1999)
• [文献書誌] 金田尚: "ヘムオキシゲナーゼ1欠損症1家系における遺伝子異常ならびに細胞障害機構の解析."金沢大学十全医学会雑誌. 108・1. 91-102 (1999)
• [文献書誌] 小泉晶一: "ヘムオキシゲナーゼ1欠損症発見の意義."日本醫事新報. 3945. 105-105 (1999)
• [文献書誌] 谷内江明宏: "Heme oxygenase-1欠損症と全身性血管内皮傷害:世界第1例目の報告."医学のあゆみ. 188・13. 1129-1130 (1999)
• [文献書誌] Ohta K,Yachie A,et al.: "Tubular injury as a cardinal pathological feature in human heme oxygenase-1 deficiency."Am J Kidney Dis. (印刷中).