| 研究課題/領域番号 |
11470186
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
橋本 隆 久留米大学, 医学部, 教授 (20129597)
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| 研究分担者 |
目加田 英輔 久留米大学, 分子生命研, 教授 (20135742)
名嘉真 武国 久留米大学, 医学部, 講師 (50221453)
森 理 久留米大学, 医学部, 助教授 (10175630)
伊東 恭悟 久留米大学, 医学部, 教授 (50125499)
山田 源 熊本大学, 動物資源開発技術開発部門, 教授 (80174712)
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| キーワード | デスモヨーキンケラチノサイト / 細胞接着 / 細胞内情報伝達 / ノックアウトマウス / デスモグレイン / エンボプラキン |
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| 研究概要 |
まず、デスモヨーキン(AHNAK蛋白)ノックアウトマウスの作成のための予備研究として、さらに、この蛋白の蛋白レベルでの機能の解析を進めた。デスモヨーキンのN末端・中央部・C末端部のcDNAを組み込んだ有核細胞発現系ベクターを用いた研究で、デスモヨーキンのN末端および中央部は細胞質内に分布し細胞膜および核内への移行は見られなかったが、C末端部には核内および細胞膜部両方への移行が見られた。この反応をtransfection効率をさらに高率にすることにより確認し、さらに、Laser con-focal microscopeを用いた詳細な検討でその分布の変化を明確にした。さらにこのC末端部の細胞内移行反応がカルシウムおよびTPAにより誘導されたことから、この移行にprotein kinase Cを中心とした細胞内情報伝達が重要であることが示唆された。
次いで、デスモヨーキンノックアウトマウスのためのtargeting vectorを作成するためにまず、マウスゲノムDNAライブラリーをマウスデスモヨーキンcDNAによるhybridization screeningを行った。すなわち、以前クローニングしたマウスデスモヨーキンの中央部をコードするcDNAをpBluescript vectorから切り出し、ジゴキシゲニンでラベルした。マウスゲノムDNA Lambda FIXライブラリーと大腸菌XL1Buleで作製したプラークをナイロンメンブランに転写し、DNAハイブリダイゼイションならびに化学発光法により、陽性クローンを得、数回の再スクリーニングで単離した。現在、PCR法、DNA sequencingにより、そのゲノムDNAクローンのintron-exon organizationの解析中である。来年度は、このDNAを用いてTargeting vectorを作成し、ES細胞に導入する予定である。
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