| 研究課題/領域番号 |
11470483
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
大熊 勝治 金沢大学, 薬学部, 教授 (10119563)
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| 研究分担者 |
染井 正徳 金沢大学, 薬学部, 教授 (20110546)
横山 謙 金沢大学, 薬学部, 助手 (70271377)
荒井 國三 金沢大学, 薬学部, 講師 (50126562)
太田 哲夫 金沢大学, 医学部・附属病院, 助教授 (40194170)
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| キーワード | H^+ / Cl^- / オートファジー / 分化 / アポトーシス / プロジギオシン / ドミナントネガティブ / 二次元静電気泳動 / 癌 |
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| 研究概要 |
本研究は、新規H^+/Cl^-シンポーターであるプロジギオシン類のアポトーシス誘導機構解明に当たり、これまで殆ど注目されてこなかったオートファジーの役割を、体細胞遺伝学的・分子生物学的に明らかにしょうとした。先ず、(1)プロジギオシン類のアポトーシス誘導機構をオートファジーに注目して解明。動物細胞オートファジー関連遺伝子の同定を目指し、(2)CHO細胞を用いてオートファジー突然変異体を単離、(3)酵母オートファジー関連遺伝子の動物細胞ホモローダを単離、(4)オートファジーに伴って発現量の変動する遺伝子・蛋白質を同定。.動物細胞オートファジー関連遺伝子が単離された暁には、(5)アポトーシスに伴うオートファジー関連遺伝子の動態を解明、(6)アポトーシスにおけるオートファジー関連遺伝子機能を、トランスフェクタント(ドミナント・ネガティブ体の強制発現等を含む)作成を通じて解明。平行して、(7)各種癌細胞に対する、H^+/Crシンポーターのアポトーシス誘導型制癌剤の可能性を追及、した。
先ず、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いて、Wortmannin, 3-methyladenine他の各種選択的阻害剤を用いて解明する系を確立した。次に、プロジギオシン類H^+/Cl^-シンポーターの、オートファジー・アポトーシス制御における働きを、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いて、蛍光を指標として生化学的・細胞生物学的に解析した。同時に、細胞内pH測定を通じて、H^+/Cl^-シンポーターのどのような活性が関与するかを解析した。その結果、PC12細胞の分化誘導とアポトーシス誘導にはオートファジー自体は関与していないことが示唆された(日本薬学会発表)。
また、体細胞分子遺伝学的にオートブァジー変異体の単離を目指して、CHO細胞を用いて実験系を確立した。今後、(毒素等を利用した)細胞生存率と、強制発現させたGFP蛋白質の分解異常を指標とし、フローサイトメトリー・セルソータ一法を主に使い、動物細胞のオートファジー変異体を選択したい。
リソソーム膜融合反応に必要なシンタキシン・ホモローグの単離・同定には成功しているが、それがオートファゴソームとリソソームの膜融合に必須であるか否かは決定出来ていない。酵母遺伝子のヒトホモログ釣りは成功し、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いてドミナントネガティブ体を作成し、その遺伝子産物の動物細胞オートファジーにおける役割を解明した(投稿準備中)。
また、一次元・二次元電気泳動法等を用いて、オートファジーに伴い量的に変動する蛋白質を単離・同定。現在、各種処理で誘導されるタンパク質に差を見い出している(投稿準備中)。更に、種々の合成化合物について、H^+/Cl^-シンポーターとして満たすべき構造を検討している。ヌードマウスに移植した膵癌由来細胞に対して、プロジギオシン類似体H^+/Cl^-シンポーターも制癌効果を示すことを見い出している(投稿準備中)。
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