DNA複製開始蛋白質DnaAの機能ドメインと高次構造の決定

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11470486
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 土屋 友房 岡山大学, 薬学部, 教授 (80012673)
• 研究分担者: 月原 冨武 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (00032277) ; 見尾 光庸 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 助教授 (70190600) ; 水島 徹 岡山大学, 薬学部, 助教授 (00264060) ; 小林 佐賀恵 岡山大学, 薬学部, 助教授 (90212654) ; 増田 和文 岡山大学, 薬学部, 助手 (00243486)
• キーワード: DNA複製 / DnaA / ADP / ATP / 活性調節 / ATPase

研究概要

大腸丙菌の複製開始因子DnaAは酸性リン脂質と相互作用し、この相互作用によって、細胞内DNA複製が制御されていると考えられている。昨年度までに我々はこの酸性リン脂質との結合に関与する二つの塩基性アミノ酸残基(328番目のアルギニンと372番目のリジン)を同定した。今年度我々はこれらのアミノ酸両方に変異を持つ変異DnaA蛋白質(DnaA435)を構築しその生化学的解析を行った。DnaA435は、それぞれ単独の変異を持つ変異DnaA蛋白質(DnaAR328E、及びDnaAK372E)に比べ、より酸性リン脂質と相互作用しにくいことが分かった。従ってこれらの両アミノ酸残基は、協調的に酸性リン脂質との相互作用に関与していることが考えられる。興味深いことに、DnaA435.はATPと結合できないにも関わらず、複製開始活性を持っていた。これらの事実から我々は、DnaAのATP結合と酸性リン脂質結合に関し、新たなモデルを提唱した。
DnaAは塩基配列特異的にorigin DNAに結合するだけでなく、塩基配列非特異的にDNAに結合する。このDnaAの塩基配列非特異的なDNA結合活性に関してはこれまでほとんど解析されてこなかったので、今年度我々はその生化学的な解析を行った。その結果、塩基配列非特異的なDNA結合活性はATP、及びADPによって阻害されること、及び37度でのインキュベイションを必要とすることを発見した。さらに我々は様々な変異DnaA蛋白質の塩基配列非特異的なDNA結合活性を測定し、膜リン脂質と結合できない変異DnaA蛋白質は、塩基配列非特異的なDNA結合活性も失っていることを発見した。

研究成果

• [文献書誌] Hoshino, T.: "Prostaglandin E_2 protects gastric mucosal cells from apoptosis via EP_2 and EP_4 receptor activation"J.Biol.Chem.. (in press).
• [文献書誌] Takahashi. N.: "Functions of sensor 1 and sensor 2 regions of Saccharomyces cerevisiae Cdc6p in vivo and in vitro"J.Biol.Chem.. 277. 16033-16040 (2002)
• [文献書誌] Makise, M.: "Acidic phospholipids inhibit the DNA binding activity of DnaA protein, the initiator of chromosomal DNA replication in Escherichia coli"Mol.Microbiol.. 46. 245-256 (2002)
• [文献書誌] Lee, J.R.: "Inhibitory effects of acidic phospholipids on the binding of Origin Recognition Complex to Origin DNA"Biochem.J.. 362. 395-399 (2002)
• [文献書誌] Makise, M.: "Biochemical analysis on DnaA protein with mutations in both Arg328 and Lys372"Biochem.J.. 362. 453-458 (2002)
• [文献書誌] Mima, S.: "Conserved hydrophobic amino acid residues in the N-terminal region of DnaA protein are involved in DnaA-DnaA interaction"Biochem.J.. 365. 881-887 (2002)