1999 年度実績報告書

モノクローナル抗体を用いた遺伝子損傷の高感度検出系の開発とその応用

研究課題

研究課題/領域番号	11470498
研究種目	基盤研究(B)
研究機関	金沢大学
研究代表者	二階堂修金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)
研究分担者	石垣靖人金沢大学, 薬学部, 助手 (20232275) 松永司金沢大学, 薬学部, 助教授 (60192340)
キーワード	ヌクレオチド除去修復 / モノクローナル抗体 / シクロブンタン型ピリミジンニ量体 / (6-4)光産物 / キャピラリー電気泳動 / DNA損傷 / 蛍光標識抗体
研究概要	本研究で樹立を目指す超高感度DNA損傷検出系は、キャピラリー電気泳動装置とDNA損傷を認識するマウスモノクローナル抗体(1次抗体)、及びマウスIgGを認識する蛍光標識2次抗体から構成される。本年度は、本検出系に必要な材料の調整と、キャピラリー電気泳動の条件設定等を中心に行った。まず、1次抗体として、シクロブタン型ピリミジンニ量体を特異的に認識するTDM-2、また(6-4)光産物を特異的に認識する64M-2、64M-3、64M-5抗体を大量に調製した。方法としては、抗体産生細胞を完全無血清培地(タンパク成分不含)に馴化させ、上清を大量に集めた後、硫安塩析により1ステップでほぼ均一に精製した。キャピラリー電気泳動の基礎実験では主にTDM-2抗体を使用し、Alexa^<TM>488で標識された2次抗体、ならびに紫外線(0、5、10J/m^2)を照射された細胞から抽出したDNA(熱変性したもの)と反応させた後、ノンコーティング・シリカキャピラリー(直径25μm x 40cm)を用いて分析を行った。また、泳動バッファーは20mM borate/10mM Tris-HCl(pH10.5)を使用し(電圧400V/cm)、488nmのレーザーで2次抗体に標識されている蛍光物質を指標に検出した。その結果、2次抗体単独と1次抗体-2次抗体の複合体は分離することができなかったが、照射された紫外線の線量に依存して増加するピークが検出され、1次抗体-2次抗体-DNAの3種の複合体であると推定された。今後は、細胞から抽出されたDNAのサイズ等についても検討する必要があり、さらに感度を上げるべく様々な分析条件を検討していく予定である。

研究成果
(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] Harada,Y.-N.: "Postnatal growth failure, short life span, and early onset of cellular senescence and subsequent immortalization in mice lacking the xeroderma pigmentosum group G gene."Mol.Cell.Biol.. 19. 2366-2372 (1999)
[文献書誌] Ahmed,N.U.: "High levels of 8-hydoroxy-2'-deoxyguanosine appear in normal human epidermis after a single dose of ultraviolet radiation."Brit. J. Dermatol.. 140. 226-231 (1999)
[文献書誌] Hada,M.: "Photoregulation of DNA photolyase in Broom Sorghum seedings."Photochem.Photobiol.. 69. 681-685 (1999)
[文献書誌] Ishigaki,Y.: "Development and characterization of a DNA solar dosimeter."J.Photochem.Photobiol.B:Biol.. 50. 184-188 (1999)
[文献書誌] Kobayashi,H.: "Probing the interaction between a high-affinity single-chain Fv and a pyrimidine (6-4) pyrimidone photodimer by site-directed mutagenesis."Biochmistry.. 38. 532-539 (1999)
[文献書誌] Torizawa,T.: "Conformational multiplicity of the antibody combining site of a monoclonal antibody specific for a (6-4) photoproduct."J.Mol.Biol.. 290. 731-740 (1999)
[文献書誌] Torizawa,T.: "DNA binding mode of the Fab fragment of a monoclonal antibody specific for cyclobutane pyrimidine dimer."Nucl.Acids Res.. 28. 944-951 (2000)

1999 年度 実績報告書

モノクローナル抗体を用いた遺伝子損傷の高感度検出系の開発とその応用

研究代表者

二階堂 修 金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)

研究成果

[文献書誌] Harada,Y.-N.: "Postnatal growth failure, short life span, and early onset of cellular senescence and subsequent immortalization in mice lacking the xeroderma pigmentosum group G gene."Mol.Cell.Biol.. 19. 2366-2372 (1999)

[文献書誌] Ahmed,N.U.: "High levels of 8-hydoroxy-2'-deoxyguanosine appear in normal human epidermis after a single dose of ultraviolet radiation."Brit. J. Dermatol.. 140. 226-231 (1999)

[文献書誌] Hada,M.: "Photoregulation of DNA photolyase in Broom Sorghum seedings."Photochem.Photobiol.. 69. 681-685 (1999)

[文献書誌] Ishigaki,Y.: "Development and characterization of a DNA solar dosimeter."J.Photochem.Photobiol.B:Biol.. 50. 184-188 (1999)

[文献書誌] Kobayashi,H.: "Probing the interaction between a high-affinity single-chain Fv and a pyrimidine (6-4) pyrimidone photodimer by site-directed mutagenesis."Biochmistry.. 38. 532-539 (1999)

[文献書誌] Torizawa,T.: "Conformational multiplicity of the antibody combining site of a monoclonal antibody specific for a (6-4) photoproduct."J.Mol.Biol.. 290. 731-740 (1999)

[文献書誌] Torizawa,T.: "DNA binding mode of the Fab fragment of a monoclonal antibody specific for cyclobutane pyrimidine dimer."Nucl.Acids Res.. 28. 944-951 (2000)

1999 年度実績報告書

二階堂修金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)