| 研究概要 |
糖鎖合成酵素の固定化とプライマーの作製
糖鎖自動合成装置の開発において鍵となる「糖転移酵素」を繰り返し利用するために固定化の検討を行った。まず、既存の固定化法(CNBr活性化Sepharose)を用いて酵素を固定化し利用することが可能であることを、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ、α2,3-シアリルトランスフェアーゼ、α1,3-フコシルトランスフェラーゼで確認した。更に、糖転移酵素をマルトース結合蛋白質(MBP)との融合蛋白質の状態で大腸菌に生産させ、側鎖にマルトースを持つ高分子に結合させる固定化法を開発した。糖転移酵素をMBPと融合蛋白質の形で生産することにより、酵素精製や固定化の効率化が期待できる。この方法で、β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼの固定化に成功した。
糖鎖合成の出発物質となるプライマーの開発も平行して行った。糖転移酵素は、糖の存在密度が高い場合や、糖が蛋白質またはその代りとなる高分子と共に存在するときにその活性が著しく高くなる場合が多い。そのため、水溶性高分子に糖を結合させてプライマーとし、糖転移反応に供し糖鎖合成の効率化を図った。プライマーとしても2つの手法を確立した。一つは糖鎖と高分子の間にフェニルアラニンを入れるようデザインしたもので、糖鎖がキモトリプシンにより遊離できる利点がある。もう一つの方法は糖脂質の一種であるセラミドを高分子に結合したデザインで、エンドグリコシルセラミダーゼの転移反応活性を利用することにより、合成した糖鎖を糖脂質に転移させて任意の糖脂質を得ることができる。
今年度はこれらの固定化糖転移酵素とプライマーを開発試作し、それらが実際に働くことを確認した。糖鎖自動合成システムの基本となる酵素とプライマー技術が開発できたことにより、今後は実用化に向けた研究開発と共に、試作した糖鎖を用いて生理活性等の研究の発展が期待できる。
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