| 研究課題/領域番号 |
11480172
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| 研究機関 | (財)東京都医学研究機構 |
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研究代表者 |
川喜田 正夫 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (00012740)
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| 研究分担者 |
三木 俊明 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (10239204)
青木 和久 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (00280785)
石田 信宏 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (20291148)
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| キーワード | 糖ヌクレオチド輸送体 / UDP-ガラクトース輸送体 / UDP-ガラクトース輸送体遺伝子 / 可溶化再構成 / ヒスチジンータグ |
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| 研究概要 |
1.ヒトUGT遺伝子の単離と解析を行い、Xp11.22-p11.23に位置するUGT遺伝子を含む約20kbの領域の塩基配列を決定した。UGT遺伝子はほぼ10kbの範囲に存在し、5個のエキソンから構成されている。決定された塩基配列から、cDNAクローニングの過程で見出されていた2種のアイソザイムの内、hUGT1は第1〜第4エキソンから、また、hUGT2は第4エキソン内のスプライシング供与配列を用いたalternative splicingによって第5エキソンまでの領域からそれぞれ生成することが示唆された。また、UGT遺伝子の近傍1.2kb上流にはprotooncogene homologueであるpim2遺伝子が見出された。
2.UGT発現Had-1細胞のミクロソームからUGTを可溶化し、コール酸-透析法によるリン脂質膜小胞への再構成系を構築した。再構成膜小胞はミクロソーム膜と同等の、温度および時間依存性・基質濃度依存性のUDP-Gal取り込み活性を示した。さらに、UGTのC末ペプチド部分に対する特異抗体を用いた抗体力ラムによるUGTの精製を試み、抗体力ラムに吸着したコール酸可溶化輸送体タンパク質をアルカリ性条件下で溶出することによってUGTタンパク質を高度に精製し、銀染色で検出することができた。しかし、この条件下では輸送活性の低下が著しかった。そこで、輸送活性を保持した精製UGTを得ることを目的として、C末にHis-tagを付加したUGT(hUGT-cHis)をHad-1細胞中で発現させ、hUGT-cHisの可溶化、精製、および再構成を行った。hUGT-cHisを導入したHad-1細胞(Had-1/hUGT-cHis)から得たミクロソーム膜(粗ゴルジ膜)をコール酸で可溶化し、Ni-キレートカラムへの吸着およびイミダゾールによる溶出を2回繰り返すことにより、SDSゲル電気泳動上で銀染色によって認められる夾雑タンパク質が数種類となる程度にまでhUGT-cHisタンパク質を高度に精製することができた。
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