細胞極性化を制御する普遍的な分子機械「aPKC/ASIPシグナル複合体」の解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11480182
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 大野 茂男 横浜市立大学, 医学部, 教授 (10142027)
• 研究分担者: 秋本 和憲 横浜市立大学, 医学部, 助手 (70285104) ; 鈴木 厚 横浜市立大学, 医学部, 講師 (00264606) ; 平井 秀一 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (80228759)
• キーワード: aPKC / ASIP / PAR-3 / PAR-6 / 線虫 / 非対称分裂 / 極性

研究概要

線虫の初期胚における非対称分裂に先立つ細胞の極性化に必須のタンパク質、PAR-3はaPKCと複合体を形成し、共同して線虫初期胚の非対称分裂に先立つ細胞の極性化を制御している。ほ乳類でも、aPKCはASIP/PAR-3と複合体を形成し、上皮の極性化の要と考えられているtight junctionに局在する。この一連の発見は、「aPKC及びASIP/PAR-3を含むシグナル伝達複合体」が線虫の初期発生から、ほ乳類上皮の極性化にまで保存された極めて普遍的なシグナル制御因子であることを示唆している。本年度は、この「aPKCとASIP/PAR-3を含むシグナル伝達複合体」に特に注目し、その構成員と分子組成、分子間相互作用、細胞接着シグナルによるリン酸化等を含む制御機構を解析した。具体的には、ASIPとaPKCとの生化学的な関係を詳細に解析し、ASIPがaPKCのアンカリングタンパク質であると同時に基質でもある事を示し、リン酸化部位を同定した。さらに、リン酸化部位を認識する抗体を作成し、上皮の極性化に伴いASIP-S827のリン酸化が起きることを確認した。実際に、キナーゼ活性を欠くaPKC変異体をうどうsアデノウイルスベクターを用いて培養上皮細胞に導入すると、細胞接着によって誘導通り、されるtight junction形成や、膜タンパク質の局在かを顕著に抑制することを見いだした。予想通り、「aPKCとASIP/PAR-3を含むシグナル伝達複合体」は、上皮の極性形成においても死活的に重要な役割を果たしていることが明らかとなったことになる。
この、「aPKCとASIP/PAR-3を含むシグナル伝達複合体」の更なる構成員を検索する一貫として、PAR-6のほ乳類、mPAR-6のクローニングと生化学的な性状解析を行った。その結果、aPKCとASIP/mPAR-3及びmPAR-6を含む3者複合体を構成していることを明らかにした。相互作用部位の詳細な絞り込みにより新たなタンパク質相互作用モチーフが関わっていることも見いだした。抗体を用いた詳細な解析により、このPAR-6,aPKC,ASIPの三者複合体は、上皮の細胞接着に伴い接着部位に集合し、極性化に伴いアピカル側に移動して、最終的にtight junction構成の裏打ち部位に集まることも明らかとした。

研究成果

• [文献書誌] Akita,Y., Kawasaki,H., Ohino,S., Suzuki,K., and Kawasaki. S.: "Involvement of protein kinase C epsilon in thyrotrpin-releasing hormone-stimulated phosphorylation of the myristoylated alanine-rich C kinase substrate in rat pituitary clonal cells."Electrophoresis. 2. 452-459 (2000)
• [文献書誌] Okuda,H., Hirai,S. Takasaki,Y., Kamata.M., Baba,M., Sakai,N., Kishida,T., Kaneko,S., Yao,M., Ohno,S., and Shuin,T.: "Direct Interaction of the b-domain of VHL Tumor Suppressor Protein with the Regulatory Domain of Atypical PKC Isotypes."B. B. R. C.. 263. 491-497 (1999)
• [文献書誌] Miranti,C.K., Ohono,S. and Brugge,J.S.: "Protein kinase C regulates integrin-induced activation of the extracellular regulated kinase pathway upstream of Shc."J. Biol. Chem.. 274. 10571-10581 (1999)
• [文献書誌] Izumi,Y., Hirose,T., Tamai,Y., Hirai,S-I., Nagashima,Y., Fujimoto,T., Tabuse,Y., Kemphues,K.J. and Ohono,S.: "An atypical PKC directly associates and co-localizes at the epithelial tight junction with ASIP,a mammalian homologue of Caenorhabditis elegans polarity protein PAR-3."J. Cell Biol.. 143. 95-106 (1998)
• [文献書誌] Akimoto,K., Nakaya,M., Yamanaka,T., Tanaka,J., Matsuda,S., Weng,Q-P., Avruch, J. and Ohno,S.: "Atypical PKCλ binds and regulates p70 S6 kinase."Biochem.J.. 335. 417-424 (1998)
• [文献書誌] Tabuse,Y., Izumi,Y., Piano,F., Kemphues,K.J., Miwa,J. and Ohno,S.: "Atypical Protein Kinase C Coperates with PAR-3 to Establish Embryonic Polarity in Caenorhabditis elegans."Development.. 125. 3607-3614 (1998)