GFPを利用した分子スパイの開発と、細胞機能動態の可視化

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11480186
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 理化学研究所
• 研究代表者: 宮脇 敦史 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, チームリーダー(研究職) (80251445)
• 研究分担者: 水野 秀昭 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 ; 濱 裕 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員
• キーワード: カルシウムイメージング / cameleon / GFP / RFP / レーザー走査顕微鏡 / プレートイメージアナライザー / 蛍光偏光度測定

研究概要

CameleonによるCa^<2+>イメージングの革命
以前、申請者は低pHに耐性のyellow cameleon (長波長シフトのcameleon)を作製したため、小胞体の中でフォールディング効率が低下するという欠点を持つことが判明した。今回pHに耐性かつフォールディング効率の高いYFPを開発し、それを用いることでyellow cameleonを更に改善した。特に小胞体中の遊離カルシウムの濃度を測定する際に威力を発揮するものと期待している。
細胞質yellow cameleonを用いて光学系の至適化を検討した。その結果、一光子レーザー走査顕微鏡(日立金属、固体レーザー、430nm)を使えば満足のゆくCa^<2+>濃度の断層像が得られることがわかった。
1999年秋に、イソギンチャクよりRed Fluorescent Protein(RFP)がクローニングされた。申請者は、RFPに基つく蛍光指示薬を開発するため、RFPの蛍光特性の解析、および改変RFPの作製に着手している。改変RFPをプレート上のコロニー毎に調べるプレートイメージアナライザーを、購入したSencys CCDカメラを使って構築した。蛋白質のリガンド結合、蛋白質間の相互作用を指示薬の創製に応用するべく、GFP(RFP)融合蛋白質を、購入したBeacon(蛍光偏光度測定器)で解析するシステムをセットアップした。

研究成果

• [文献書誌] Miyawaki A.,Tsien R.Y.: "Monitoring Protein Conformations and Interactions by Fluorescence Resonance Energy Transfer Between Mutants of Green Fluorescent Protein"Methods in Enzymology, Chimeric Proteins. (1999)
• [文献書誌] Miyawaki A.,Llopis J.,Mizuno H.,Jelink K.,Tsien R.Y.: "Cameleons as cytosolic and intra-organellar calcium probes"Oxford University Press, Calcium Signaling : A Practical Approach. (1999)
• [文献書誌] Mikoshiba K.,Furuichi T.,Miyawaki A.et al.: "Role of Inositol 1,4,5-Trisphosphate(IP_3) Receptor/Ca^<2+> Signaling in Cell Function"Japan Scientific Societies Press, Challenges for Neuroscience in the 21^<st> Century. 121-146 (1999)
• [文献書誌] Matsushita F.,Miyawaki A.,Mikoshiba K.: "Vomeroglandin/CRP-ductin is strongly expressed in the gland associated with the mouse vomeronasal organ : identification and characterization of mouse vomeroglandin"Biochemical and Biophysical Research Communications. (2000)