研究概要 |
まず顕微鏡システムのセットアップと試料である大腸菌RNAポリメラーゼの調製を行った。顕微鏡下で転写反応を観察するのと同じ条件下で、RNAポリメラーゼの活性を測定した。次に非常に強力なプロモーターとして知られているA1プロモーターを唯一の大腸菌RNAポリメラーゼのプロモーターとする欠失突然変異T7ファージを鋳型に、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、A1プロモーターを含む、長さ2マイクロメーター程度のDNAをPCR法で調製した。その際、片方のプライマーとするオリゴヌクレオチドをビオチン化しておきDNAの片端をビオチン化した。合成したDNAとRNAポリメラーゼをATP,GTP,CTP,ApU存在下で30度、3分程度処理するとRNAポリメラーゼはA1プロモーター部位から転写を開始し、20番目のAのところで転写を休止し、いわゆるstalled complexを形成することを確認した。この転写複合体をガラス基板上に固定しDNAの片端にストレプトアビジンビーズを結合させ、、NTPを加えビーズのブラウン運動を観察した。はじめビーズは激しくブラウン運動しているが、転写が進むにつれて、DNAがRNAポリメラーゼにたぐり寄せられていき、ビーズのブラウン運動がしだいに小さくなり、最後にはDNAが完全にたぐり寄せられてしまい。ビーズのブラウン運動が停止するのが観察できた。ブラウン運動停止までの時間とDNAの長さからRNAポリメラーゼの転写活性を見積もることができた。
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