| 研究課題/領域番号 |
11480198
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
分子生物学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
上田 卓也 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 教授 (80184927)
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| 研究分担者 |
鈴木 勉 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 講師 (20292782)
大矢 禎一 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 教授 (20183767)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| キーワード | tRNA / アミノアシル化 / メチル基 / 転写反応 / 多義語コドン / コドン認識 |
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| 研究概要 |
我々はCandida酵母においてCUGコドンがセリンとロイシンの2種のアミノ酸を同時に指定していることを、tRNAの解析と遺伝学的な手法により明らかにした。この多義的な遺伝暗号変換機構のCandida酵母における生物学的意義を解明するために、多義語コドンを司るtRNASerCAGのロイシン受容能を定量的に変化させ、細胞内あるいは生育への影響を解析しようとしている。これまでの解析によりtRNA^<Ser>CAGのロイシン受容能はアンチコドン3'側隣接塩基である37位の1-メチルグアノシン(mlG)のメチル基によって支配されていることが明らかになっている。今回はさらに受容能を向上させるために、73位の識別部位をGからAに改変することを試みた。細胞内に変異tRNAを発現させる前に、in vitroでロイシン受容能を評価するために、T7RNApoIymeraseを用いた未修飾tRNAを作製したがロイシンの取り込みは全く検出されなかった。さらに、今回新たに大腸菌m^lG methylaseを組換えタンパク質として調製し、未修飾tRNAの37位をメチル化したところ、nativeなものとほぼ同等のロイシン受容能が確認された。この結果は分子内のたった一つのメチル基がアミノアシルtRNA合成酵素の決定因子になりうることを直接的に示した初めての例である。さらに、73位の識別部位をAに置換すると、ロイシン受容能は飛躍的に向上しnativeなtRNA^<Ser>CAGをはるかに凌ぐ活性が確認された。Kcat/Kmの値としては、識別塩基がAへの変異は400倍の上昇を、37位をGからm^lGにしたtRNAでは、10倍の上昇が観察された。これらの結果を基に、細胞内でこれらの変異型tRNAを導入し、細胞機能の変化を観察する予定である。
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