RNAポリメラーゼサブユニット5を介した転写活性化機構と新規転写補助因子RMP

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11480200
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 村上 清史 金沢大学, がん研究所, 教授 (90019878)
• 研究分担者: 林 直之 金沢大学, がん研究所, 助手 (50253456) ; 野村 孝弘 金沢大学, がん研究所, 助教授 (80115261)
• キーワード: RNAポリメラーゼサブユニット5(RPB5) / 転写制御 / HBVX蛋白 / RMP / TFIIF / 転写の補助因子

研究概要

RNAポリメラーゼサブユニット5(RPB5)のexposedドメインは、Pol IIの下顎を構成し、活性化転写の制御に関わり、転写基本因子及びB型肝炎ウイルスX蛋白と相互作用する。RPB5の結晶モデルは、exposedドメインが転写開始点下流のDNAと近接した位置にあることを予測した。我々は、1)精製組み換え型RPB5がin vitroで、2重鎖DNAセルロースカラムと特異的に結合することを見い出した。この結合にはRPB5のexposedドメインが必要であった。2)RPB5の中央部の集約型アラニン置換変異を用いた結果は、少なくとも離れた2ケ所のアミノ酸配列が、次いで点置換アラニン変異を用いた解析から、4アミノ酸残基がDNA結合能に必須である結果を得た。その内Tl11及びSl13の2残基は分子の外側に位置し、DNAとの接触に直接寄与すると推定された。結晶モデルで2つのプロリン残基の寄与が予測されたが、我々の解析ではプロリン残基の影響を認めなかった。2)RPB5の中央部が転写基本因子TFIIFのサブユニットRAP30の中央部と特異的に結合し、この結合は転写過程でのPolIIとTFIIFに関わっていることが推定された(J.Biol. Chem.,2001)。RPB5との相互作用の局面で、HBV X蛋白に拮抗する新規蛋白RMPの機能解析を目的として、酵母Two-hybrid法でRMPに相互作用する蛋白を選択した。その結果、RMP自体が単離され、in vitro及び培養細胞系でhomomericな相互作用を確認した。繰り返し単離された候補cDNAは、DNAメチル化に関わりcorepressor機能が報告されているクローンであった。培養細胞で異なるタグ標識したこの蛋白とRMPを発現させた系で、両者の特異的結合が認められた。両者の結合の転写への影響の検討が今後に残された。

研究成果

• [文献書誌] Qin, W., et al.: "Mutational Analysis of the Structure and Functions of Hepatitis C Virus RNA-dependent RNA polymerase"Hepatol.. 33. 728-737 (2001)
• [文献書誌] Wei, W., et al.: "Direct interaction between the subnit RAP30 of TFIF and RNA polymerase subnit 5(RPB5)which contributes to the association between TFIF and RNA polymerase II"J. Biol. Chem.. 276. 12266-12273 (2001)
• [文献書誌] Murakami, S.: "Hepatitis B Virus X protein : A multifunctional regulatory protein"J Gastroenterol. 36. 651-660 (2001)
• [文献書誌] 村上清史: "ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)の発現・精製とヒトテロメラーゼ活性の試験管内の再構成(前)"教育通信. 23. 24-25 (2001)
• [文献書誌] 村上清史: "ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)の発現・精製とヒトテロメラーゼ活性の試験管内の再構成(後)"教育通信. 24. 22-23 (2001)
• [文献書誌] Qin, W., et al.: "Oligomeric interaction of Hepatitis C Virus NS5B is critical for catalytic activity of RNA dependent RNA polymerase"J. Biol. Chem.. 277. 2132-2137 (2002)
• [文献書誌] Arai, K., et al.: "Two independent regiogns of human telomerase reverse transcriptase(hTERT) are important for their oligomerization and telomerase activity"J. Biol. Chem.. (In press). (2002)
• [文献書誌] Shirota, T., et al.: "Hepatitis C Virus NS5A Binds RND-Dependent RNA Polymerase NS5B and modulates RdRP activity"J. Biol. Chem.. (In press). (2002)