モノオキシゲナーゼの構築―P450酸化活性種の蛋白モデルによる検証

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11490036
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 岡崎国立共同研究機構
• 研究代表者: 渡辺 芳人 岡崎国立共同研究機構, 分子科学研究所, 教授 (10201245)
• 研究分担者: 小江 誠司 岡崎国立共同研究機構, 分子科学研究所, 助手 (60290904) ; 小崎 紳一 山形大学, 教育学部, 助教授 (40280581)
• キーワード: ヘム蛋白質 / ペルオキシダーゼ / ミューテーション / P450 / ミオグロビン

研究概要

ヘム蛋白は、生体内で様々な役割を果たしているが、多様な機能を共通の活性中心(ヘム)を用いて発現させるために、ヘム近傍残基の役割が重要と考えられる。本研究は、酵素を規範として本来酵素活性に乏しいヘム蛋白質のヘム近傍構造を改変し、高い酸素原子添加機能を有するシトクロームP450類似機能を賦与することが第一の目的である。具体的には、分子状酸素の運搬体であるミオグロビン(Mb)の基本骨格を利用し、酸素添加酵素への機能改変を達成するため部位特異的アミノ酸置換を行った。
今回研究に用いたMbミュータントの酸化活性種がcompound I様の化学種か否かを検討するために、各種酸化剤との反応を吸収スペクトル変化から追跡したところ、m-chloroperbenzoic acidとF43H/H64Lとの反応において、compound Iと類似のスペクトルを示す中間体が得られた。この中間体は、1)スルフィドやスチレンの添加により速やかに鉄三価に還元され、2)反応生成物が酸化剤に対しほぼ100%得られたことから2電子酸化当量を持つことは明らかであり、compound Iと考えられる。これはMbのcompound Iを観測した初めての例であり、変異体はcompound Iを効率的に外来基質の酸化に用いることで、酸素添加活性を飛躍的に向上させていると考えられる。
本変異ミオグロビンを用いてスルフィドヘの酸素添加反応を検討した。合成モデルや西洋ワサビペルオキシダーゼとの比較検討の結果から、ペルオキシダーゼでは一電子移動を伴う酸化反応であるのに対し、変異ミオグロビンは直接の酸素添加、すなわち二電子酸化機構で進行していることが明かとなった。

研究成果

• [文献書誌] Y. Goto 他: "Mechanisms of Sulfoxidation Catalyzed by High-Valent Intermediates of Heme Enzymes : Electron Transfer vs Oxygen Transfer Mechanism"J. Am. Chem. Soc. 121. 9497-9502 (1999)
• [文献書誌] T. Matsui 他: "Formation and Catalytic Roles of Compound I in the Hydrogen Peroxide-Dependent Oxidations by His64 Myoglobin Mutants"J. Am. Chem. Soc. 121. 9952-9957 (1999)
• [文献書誌] T. Murakami 他: "Effects of the Arrangement of Distal Catalytic Residue on Regioselectivity and Reactivity in the Coupled oxidation of Sperm Whale Myoglobin Mutants"J. Am. Chem. Soc. 121. 2007-2011 (1999)
• [文献書誌] S. Ozaki 他: "Asymmetric Oxidation Catalyzed by Myglobin Mutants," Tetrahedron Asymmetry"Tetrahedron Asymmetry. 10. 183-192 (1999)
• [文献書誌] T. Matsui 他: "Effects of the Location of Distal Histidine in the Reaction of Myoglobin with Hydrogen Peroxide"J. Biol. Chem.. 273. 2838-2844 (1999)
• [文献書誌] Y. Watanabe: "High-Valent Intermediates"The Porphyrin Handbook. 4. 9497-9502 (1999)
• [文献書誌] M.P. Roach 他: "Investigations of the Myoglobin Cavity Mutant H93G with Unnatural Imidazole Proximal Ligands as a Modular Peroxide O-O Bond Cleavage Model System"Biochemistry. 39. 2007-2011 (1999)