脂質代謝の転写調節因子SREBPを制御するプロテアーゼ群の解明と新規治療法

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11557080
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 児玉 龍彦 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (90170266)
• 研究分担者: 川邊 良樹 中外製薬株式会社, 創薬研究所, 研究員 ; 浜窪 隆雄 東京大学, 先端科学技術研究センター, 助教授 (90198797)
• キーワード: SREBP / LDL受容体 / HMG-COA還元酵素 / プロテアーゼ / SCAP / SIP / コレステロール

研究概要

(1)SREBP切断プロテアーゼの研究
ハムスター肝臓から計画案に示されたプロテアーゼの精製を進め、プロカテプシンbに続いて第二のプロテアーゼを精製しアミノ酸配列の決定からネプリリシンと同定した.
ステロール感受性のSREBPプロテアーゼと考えられるS1PはERからゴルジにおいて、ステロースセンサーであるSCAPにより活性化されてSREBPと切断すると考えられるが、その分子機構は不明である.そこでバキュロウイルスに新規の膜蛋白発現システムを開発し、SCAPとSREBPの共発現を行った.バキュロウイルスではこれら蛋白は比較的多量に発現されるが、通常の方法では分解が早くアグリゲーションを起こしやすく可溶化が困難である.そこでバディングウィルスへ発現する技術を開発し、SF9まはたhighFiveの細胞培養液中から超遠心によりえられたECV(細胞外ウィルス)に比較的多量のSCAPとSREBP2の共発現をえた.
SREBP2においては発現ウィルスを直接マウスに免疫する方法で抗体の作成に成功した.えられた発現蛋白はリゾリン脂質により可溶化に成功しモノクロナール抗体アフィニティーカラムにより精製された.
ステロール感知にかかわる多数回膜貫通蛋白ドメインはHMG-CoA還元酵素にも存在するがその作用はSCAPではコレステロールの存在が切断抑制に働くのに対し、HMG-CoA還元酵素では分解促進と逆方向に作用する.これらの分子機構の検討のため、HMG-CoA還元酵素のバキュイロウィルスECVシステムの開発を進め酵素の膜貫通部分を含めた全体の発現に成功した.
(2)SCAP,S1Pの染色体遺伝子と多型性の発見
ヒトのSCAP,S1Pの染色体遺伝子をクローニングし、その構造をきめた.また
(3)転写調節を介する薬物の開発
LDL受容体プロモーターにルシフェレースをつないだレポーター遺伝子を用いてスクリーニングされた薬物の解析を進めその分子構造決定に成功した.この分子はHMG-CoA還元酵素mRNAは変化させずに、LDL受容体mRNA量を3-5倍程度上昇させる強力な作用をもつことがわかり、細胞骨格の蛋白に作用することがわかった.
一方、HMG-CoA還元酵素阻害剤についても機能解析を進め、従来臨床に用いられているHMG-CoA還元酵素阻害剤と比較してLDL受容体mRNAを強く誘導する新規阻害剤の解析を進めた.これら新規薬剤は、細胞で同じ程度の酵素阻害の量でより強いLDL受容体mRNA誘導を示すこと、さらに受容体のLDL分解活性誘導でもより強い作用を示し臨床的にも有用な可能性が強く示唆された.

研究成果

• [文献書誌] Nakajima T,Ota N,Kodama T,Emi M: "Isolation and radiation hybrid mapping of a hiphly polymorphic CA repeatsequence at the SREBP cleavating protein (SCAP) locus"J Hum Genet. 44(5). 350-351 (1999)
• [文献書誌] Morimoto K,Wada Y,Hinagata J,Kodama T: "VXFD in the cytoplasmic domain of macrophage scavenger receptors mediates their efficient internalization and cell-surface expression"Biol Pharm Bull. 22(10). 1022-1026 (1999)
• [文献書誌] Shirai H,Murakami T,Yamada Y,Doi T,Kodama T: "Structure and function of type I and ll macrophage scavenger receptors"Tmech Ageing Dev. 111. 107-121 (1999)
• [文献書誌] Takaku M,Wada Y,Jinnouchi K,Kodama T: "An In Vitro Coculture Model of lransmigrant Monocytes and Foam Cell Formation"Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19(10). 2330-2339 (1999)
• [文献書誌] Yamaguchi M,Shirai H,Sato R,Kawabe Y,Kodama T: "Characterization of cleavage enzymes for sterol regulatory element binding protein in hamster liver microsomes"Biochem Biophys Res Commun. 258(3). 542-547 (1999)
• [文献書誌] Tarauchi Y,Kodamam T,et al.: "Increased insulin sensitivity and hypoglycemia in mice lecking the p85a subunit of phophoinositide 3 kinase"Nature Genetics. 21. 230-235 (1999)