| 研究課題/領域番号 |
11557086
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
宮川 周二 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (90273648)
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| 研究分担者 |
村上 博 日本ハム株式会社, 中央研究所, 研究員
鄭 文玉 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (60252657)
岡部 勝 大阪大学, 遺伝情報実験施設, 教授 (30089875)
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| キーワード | 異種移植 / α1-3GT / Knockout / ターゲッティングベクター / コドン / Cre-loxP system |
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| 研究概要 |
臓器特異的α1-3galactosyltransferase Knockout (α1-3GT K O)マウスの作成を目指すため、H11年度はその基礎実験として、二つの方向で実験をおこなった。
1. ターゲッティングベクターを作製した。
マウスα1-3GTのgenomeDNAの一部をオランダから譲り受け、3'側不足分はBAC(genome sustem)からPCRで必要個所を選別し補充した。
ターゲッティングベクターは、α1-3GTの機能ドメインであるエクソン9を、loxPではさむ形にし、3'側にさらに、グリーンプロテイン(GFP)とneomysine耐性遺伝子を置きさらにその3'側にloxPを置いた。
この3'側を短腕(約2kbp)とし、5'側にチミジンカイネース(tk)のDNAを置き長腕(約5kbp)とした。
2.哺乳類型CreのcDNAを製造した。
バクテリオファージP1由来のCre蛋白は34merのloxP配列を認識して組み換えを起こすが、この蛋白のもちいているコドンは哺乳類の細胞には適さないため、翻訳が十分におこなわれず、遺伝子導入した際に多くの細胞での蛋白の発現量が少なく、Cre-loxP systemによる臓器特異的α1-3galactosyltransderase Knockoutの障害となることが予想された。このため、各アミノ酸のコドンが哺乳類の細胞で利用頻度の高いコドン配列を選び、PCRを用いてそのcDNAを合成した。
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