| 研究課題/領域番号 |
11557130
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
進藤 正信 北海道大学, 歯学部, 助教授 (20162802)
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| 研究分担者 |
澤田 幸治 札幌医科大学, 医学部・附属がん研究所, 助教授 (80111128)
安田 元昭 北海道大学, 歯学部, 助手 (90239765)
東野 史裕 北海道大学, 歯学部, 助手 (50301891)
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| キーワード | E1AF / アデノウィルスベクター / 転写調節 / アポトーシス |
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| 研究概要 |
1.E1AFの上流域の解析
ヒトゲノムライブラリー(JCRB)よりヒトE1AFcDNAをプローブとしてgenomic clone λF1-20を得た。λF1-20の上流域をさらに5'-RACE法を用いて解析し、E1AF遺伝子の転写調節領域(プロモーター)のクローニングを行った。シークエンスの結果、E1AFの上流域には、TATA boxは認められなかったが、CAAT boxが存在し、p53、AP2、Sp1の結合配列が認められた。得られたE1AFプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子を含むpGL2レポータープラスミドに組み込んだ。このレポータープラスミドをE1AFが発現しているPC3やGOTO細胞に遺伝子導入し、その活性を調べたところ、約10倍の転写活性化が認められた。これに対して、E1AFの発現のみられないMCF7細胞では顕著な活性化は認められなかった。
2.E1AFプロモーターで誘導されるBIKおよびBNIP3発現アデノウイルスベクターの構築
pAd Bgl II CMV BGHpAのCMVプロモーターをE1AFプロモーターに置き換え、その下流にアポトーシスを誘導することが知られているBcl-2遺伝子ファミリーに属するBIKおよびBNIP3遺伝子を組み込んだpAd-E1AF-BIKおよびpAd-E1AF-BNIP3を構築した。このプラスミドとpJM17を293細胞にco-transfectionすることによって、recombinant Ad-E1AF-BIKおよびrecombinant Ad-E1AF-BNIP3アデノウイルスを得た。
3.細胞への遺伝子導入とアポトーシスの誘導
我々が既にE1AFを強発現していることを確認している口腔扁平上皮がん細胞HSC3、ヒト線維肉腫細胞株HT1080およひE1AFの発現のみられないヒト乳癌細胞株MCF7にウイルスを感染させ、そのアポトーシス誘導活性を検索した。その結果、HT1080では、ウイルス導入細胞で、アポトーシスの誘導が認められた。
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