新薬開発を飛躍的に効率化するハイスループットスクリーニングシステムの開発研究

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11557175
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 鎌滝 哲也 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (00009177)
• 研究分担者: 小林 智 協和発酵工業(株), 医薬総合研究所, 所長(研究・開発担当) ; 上館 民夫 北海道大学, 大学院・工学研究科, 教授 (70185990) ; 藤田 健一 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助手 (60281820)
• キーワード: P450 / ハイスループット / プレートリーダー / 阻害 / 薬物代謝 / 薬物相互作用 / 遺伝子組換え / 医薬品開発

研究概要

薬物相互作用の主な原因のひとつに, ヒトにおける主要な薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)の阻害が含まれる. そのため近年ではCYPを阻害する物質は医薬品の開発段階で除外される流れにある. この阻害作用の有無の予測を開発の初期に行うことができれば大幅な効率化につながると期待される. このことから, 膨大な数の候補化合物をヒトCYPに対する影響を基準に絞りこむための系として, ハイスループットスクリーニング(HTS)システムによるヒトCYPの触媒活性測定法の開発が待たれている. ヒトCYPの触媒活性の測定を大規模に行うためにはヒトCYPが大量に必要とされる. そこで本研究では, 大腸菌を宿主としたヒトCYPの大量発現系の樹立, およびそれを用いた薬物相互作用の大規模試験系の確立を目的とした. 13種類のヒトCYP(CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5およびCYP3A7)をそれぞれ大腸菌に発現させることに成功した. 大腸菌に発現したヒトCYPを用い, カルシウム拮抗薬であるニカルジピンが抗癌薬であるタキソールのCYP2C8による代謝を強力に阻害することを見出し, 大腸菌に発現したCYPを用いて薬物相互作用を検討できることを示した. 大腸菌に発現したヒトCYPをHTSに応用するため, これらの大腸菌を全容10Lの大量培養装置にて培養し, 一度に大量のCYPを得ることを可能にした. 我々はさらに, マイクロプレートを用いてクマリン7-水酸化酵素活性(CYP2A6)および7-エトキシレゾルフィン0-脱エチル化酵素活性(CYP1A1)を測定する系を確立した. これらの系を応用することによりヒトにおける薬物相互作用を短時間に, しかも大量に検討できるようになり, 医薬品開発の効率化に貢献できると期待される.

研究成果

• [文献書誌] Fujita, K. et al: "Predicting the Mutagenicity of Tobacco-related N-Nitrosamines in Humans Using Eleven Strains of Salmonella Typhimurium YG7108 Each Co-expressing a Form of Human Cytochrome P450 with NADPH-cytochrome P450 Reductase"Environ. Mol. Mutagen. 38. 339-346 (2001)
• [文献書誌] Fujita, K. et al: "Construction of Salmonella typhimurium YG7108 strains, each coexpressing a form of human cytochrome P450 with NADPH-cytochrome P450 reductase"Environ. Mol. Mutagen. 38. 329-338 (2001)
• [文献書誌] Fujita, K. et al: "Screening of organosulfur compounds as inhibitors of human CYP2A6"Drug Metab. Dispos. 29. 983-989 (2001)
• [文献書誌] Fujita, K. et al: "Role of Human Cytochrome P450 (CYP) in the Metabolic Activation of N-alkylntrosamines : Application of Genetically Engineered Salmonella Typhimurium YG7108 Expressing Each Form of CYP Together with Human NADPH-cytochrome P450 Reductase"Mutat. Res. 483. 35-41 (2001)
• [文献書誌] Ariyoshi N. et al: "Comparison of the Levels of Enzymes Involved in Drug Metabolism between Transgenic or Gene-knockout and the Parental Mice"Toxicologic Pathology. 29. 161-172 (2001)
• [文献書誌] Ariyoshi N., et al: "A single nucleotide polymorphism of CYP2B6 found in Japanese enhances catalytic activity by autoactivation"Biochem. Biophys. Res. Commun. 281. 1256-1260 (2001)
• [文献書誌] 鎌滝 哲也: "人類とバイオ-ナノ・バイオへの期待-"東京テクノ・フォーラム21事務局、東京. 30 (2001)