マラリアが流行する熱帯地域で使用する簡便かつ高感度なマラリアDNA診断法の開発

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11557183
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 綿矢 有佑 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 教授 (90127598)
• 研究分担者: 木村 幹男 国立感染症研究所, 感染症情報センター, 室長 (90114462) ; 金 恵淑 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 講師 (70314664)
• キーワード: マラリア / DNA診断 / LAMP法 / 熱帯熱マラリア原虫 / 等温遺伝子増幅法

研究概要

現在でもマラリアは世界的規模で流行しており、人的及び経済的損害を与える世界最大の寄生原虫感染症である。WHOの最新統計によると毎年世界中で2億7千万人がマラリア原虫に感染し、その内200万人が熱帯熱マフリア(悪性マラリア)で死亡している。世界的視野に立ってマラリア制圧の戦略を練るためには、マラリアの診断・検出法の開発は不可欠である。なぜならば、現在でもマラリアの診断には患者の血液検体をギムザ染色し、顕微鏡下で検索するという古典的な方法が取られており、正確な診断には熟練を要する。全世界で一日あたりのマラリアの感染者数は70万人以上であり、流行地では莫大な数の被験者に対して検査技師の数が追いつかないのが現状である。本研究は、顕微鏡法にかわりうる簡便で確実な診断法を開発することを研究目的とする。
我々は新しい等温遺伝子増幅法(Loop-mediated Isothermal Amplification(LAMP))を用いて流行地で遺伝子の増幅装置を必要としない新しいLAMP法を開発した。本法はマラリア原虫の18S rRNA上に4つのプライマーを設計し、65℃でマラリア原虫に特異的な反応生成物を得ることができた。本法は従来のDNA診断法に用いる遺伝子増幅装置を必要としない、反応時間は極めて短い特徴を持っている。我々は微量の血液サンプルを用いて検出可能な改良法と検出感度を従来のものよりあげるための反応条件(プライマーの設計、酵素及び試薬の添加量等)を検討し、本LAMP法で熱帯熱マラリア原虫のDNAが増幅できたことを確認した。現在、国内のマラリア患者の血液を用いてLAMP法によるマラリアの診断を行い、臨床的な特徴(病原性・血中原虫数・臨床症状の程度・合併症・薬剤に対する反応性・再発や再燃に関する情報等)とLAMP法の結果との相関を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] 綿矢有佑,金恵淑,木村幹男: "PCR法を用いたマラリアのDNA診断"病原微生物検出情報. 22. 3-4 (2001)
• [文献書誌] Hayashi,M.,Taniguchi,S.,Ishizuka,Y.,Kim,H.-S.,Wataya,Y.,yamamoto,S.and Moriyama,Y..: "A Homologue of N-ethylmaleimide-sensitive Factor in the Malaria Parasite,Plasmodium falciparum, is Exported and Localized in Vesicular Structures in the Cytoplasm of Infected Erythrocyte in the Brefeldin A-sensitive Pathway"J.Biol.Chem.,. (In Press).. (2001)
• [文献書誌] Chai,J-Y.,Guk,S-M.,Lee,S-H.,Park,Y-G.,Oh,K-H.,Oh,M-D.,Kim,H-S.and Wataya,Y.: "A trial for a DNA diagnosis of tertian malaria recently re-emerging in the Republic of Korea using microtiter plate hybridization assay."Am.J Trop.Med.Hyg.. (In Press).. (2001)
• [文献書誌] Fujishima,H.,Takeshita,H.,Toyota,M.,Kim,H.-S.,Wataya,Y.,Tanaka,M.,Sasaki,T.and Ihara,M.: "Antimalarial and cytotoxic activities of bicyclo[6.4.0]dodecanes."Chem.,Pharm.,Bull.,. (In press).. (2001)
• [文献書誌] Kimura,M.and Wataya,Y.: "Inappropriate use of mosquito bed nets in the prevention of malaria : Lessons from a familial cluster of ovale malaria"J.Travel med.,. 7. 338-339 (2000)