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平成11年度には、1)2重鏡筒対物レンズの設計と作成と2)2重鏡筒対物レンズを用いたイメージングシステムの作成、の2点を行った。
1)2重鏡筒対物レンズの作成
作成した対物レンズの特性は、倍率50倍、開口数0.8、working distanceは約0.8である。内側の鏡筒と外側の鏡筒の間に無蛍光性の塗料を塗布し、対物レンズの鏡筒から発する蛍光を0に抑えた。
2)蛍光イメージングシステムの作成
2重鏡筒対物レンズに適したシステムにするため、励起光の投光管を励起光が広範囲に照射されるように改造した。また、励起フィルターは励起光用キセノンランプの直後に、蛍光フィルターはCCDカメラの直前に設置し、従来の蛍光顕微鏡でフィルターユニットが入る部位にはスリットと全反射ミラーを設置した。これにより、励起光や蛍光の波長によらずに励起光と蛍光を分離し、フィルターホイールをコンピューター制御することにより容易に励起波長・蛍光波長を切り替えを可能にした。C6グリオーマ細胞及び副腎皮質初代培養細胞でこのシステムを評価した。両細胞とも蛍光色素Ca2+グリーン1とTMREで2重染色し、細胞質のCa2+イオン濃度変動とミトコンドリアの膜電位変動との同時計測を試みた。Ca2+イオンの画像とミトコンドリア膜電位の画像の両方とも鮮明に取得することができ、共に細胞内で時々刻々変動しているのが観察できた。また、当初問題視された励起光の強度か弱いという点は、カメラのbinningを上げるか露光時間の増加で克服できることが分かった。
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