プロテオームの新しい解析手段としてのRFHR二次元電気泳動法の実用化

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11558088
• 研究機関: 大阪医科大学
• 研究代表者: 和田 明 大阪医科大学, 医学部, 助教授 (80025387)
• 研究分担者: 吉田 秀司 大阪医科大学, 医学部, 助手 (60288735)
• キーワード: 二次元電気泳動法 / プロテオーム解析 / 大腸菌 / 定常期 / Gene-Protein Index

研究概要

プロテオーム解析における蛋白の分離は、O'FARRELLの等電点二次元電気泳動法によってほぼ独占されてきた。しかしO'FARRELL法は一次元目に極めて高い分離能をもつ反面、添加容量が小さいことや塩基性領域の分離が不充分などの弱点を持ち、それがプロテオーム解析の進歩を妨げている。
この状況を打開するため、われわれが開発したRFHR二次元電気泳動法をプロテオームに適用することを試みてきた。RFHR法は大きな添加容量を持ち、かつ塩基性、酸性の極限領域にも充分な分離能をもつため、O'FARRELL法の弱点を補うことが出来る。さらにそれ自体独立した方法として、プロテオーム解析に新しい局面を拓くべくその実用化を試みてきた。
この一年の研究成果を以下にまとめる。
1. 低温下、500V定電圧のシステムを確立して、RFHR法の分離能を向上させた。又、等電点の如何に拘わらず分離出来るように4種類の0次元泳動を開発した。
2. 昨年に引き続き、京大ウイルス研分子遺伝のグループと協力して、大腸菌のプロテオーム解析を行い、現在までに305個の蛋白遺伝子を同定した。これはG.M.CHURCHらのO'FARRELL法による223個を上回っている。この同定は継続中で400-500個の同定を目指している。現在、この結果をもとにGENE-PROTEIN INDEXを作成中である。
3. 大腸菌は対数期後の定常期に約7日間生存するが、この間の蛋白構成の変化をRFHR法で調べ、増殖段階に依存して変動する蛋白を65個検出した。このうち約1/4は定常期の全域に見出されたが、他は定常期の限られた期間に出現消滅した。これは大腸菌が刻々蛋白構成を変化させながら定常期を生き延びることを示している。そのうち39個の遺伝子を同定したが、半数が機能未知であった。。
4. 昨年、日本エイドーと協力して、RFHR法の泳動装置を実用化したが、現在分離能を向上させた改良型を制作中である。

研究成果

• [文献書誌] Tetsuo Shirakawa,Yasushi Maki,Hideji Yoshida,Nobuko Arisue,Akira Wada,Lidya B.Sanchez,Fuminori Nakamura,Miklos Muller & Tetsuo Hashimoto: "Characterization of the ribosomal proteins of the amitochondriate protist, Giardia lamblia"Molecular & Biochemical parasitology. 112. 153-156 (2001)
• [文献書誌] Kaori Izutsu,Chieko Waka,Yuriko Komine,Tomoyuki Sako,Chihiro Ueguchi & Akira Wada: "Escherichia coli Ribosomal-Associated Protein SRA, Whose Copy Number Increases during Stationary Phase"J.Bacteriology. 183 9(in press). (2001)
• [文献書誌] Tsutomu Suzuki,Maki Terasaki,Chie Takemoto-Hori,Takao Hanada,Takuya Ueda,Akira Wada & Kimitsuna Watanabe: "Structural compensation for deficit of rRNA with proteins in mammalian mitochondrial ribosome ; systematic analysis of protein components of the large ribosomal subunit from mammalian mitochondria"J.Biological Chemistry. (in press). (2001)
• [文献書誌] Yasushi Maki,Hideji Yoshida & Akira Wada: "Two proteins, YfiA and YhbH, associated with resting ribosomes in stationary phase Escherichia coli"Genes to Cells. 5. 965-974 (2000)
• [文献書誌] Akira Wada,Riitta Mikkola,Charles G.Kurland & Akira Ishihama: "Growth phase-coupled changes of the ribosome profile in natural isolate and laboratory strains of Escherichia coli"J.Bacteriology. 182. 2893-2899 (2000)
• [文献書誌] Toshimitsu Maeda,Ikuo Yoshinaga,Tsuneo Shiba,Masatada Murakami,Akira Wada & Yuzaburou Ishida: "Cloning and sequencing of the gene encoding an aldehyde dehydrogenase that is induced by growing Alteromonas sp.Strain KE10 in a low concentration of organic nutrients"Applied and Environmental Microbiology. 66. 1883-1889 (2000)