プロテオームの新しい解析手段としてのRFHR二次元電気泳動法の実用化

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11558088
• 研究機関: 大阪医科大学
• 研究代表者: 和田 明 大阪医科大学, 医学部, 助教授 (80025387)
• 研究分担者: 吉田 秀司 大阪医科大学, 医学部, 助手 (60288735)
• キーワード: プロテオミクス / RFHR二次元電気泳動法 / 大腸菌 / 等電点 / O'Farrell法 / 塩基性蛋白質

研究概要

本研究の最終年度として、RFHR二次元電気泳動法の更なる改良と、大腸菌プロテオミクスへの適用を進めた。
1.大腸菌プロテオミクスで324個の蛋白遺伝子を同定した。
RFHR法は、O'Farrellの等電点法と比べると、1.等電点の制約を受けないこと、2.蛋白の添加容量が大きいこと、3.人為的なスポットの分裂を起こさないことなどの長所によって、50%を越える高い同定率(遺伝子同定数/スポット検出数)をもち、現在までに324個の蛋白遺伝子を同定した。これはO'Farrellの等電点法の223個を既に遥かに凌駕しており、二次元ゲルを用いた同定としては、大腸菌で最大となった。
2.RFHR法の分離能を向上させ、詳細な検出と同定を可能にすることを試みた。
RFHR法は上記の長所をもつ反面、スポットの分離能力に劣る。これは等電点法を採用しないために一次元方向の濃縮がO'Farrell法程高くならないことに主な原因があるが、それ以外にも泳動条件の不充分さも影響している。この一年で泳動を低温高電圧化することを試み、水没型の新しい装置を考案した。これによって従来の標準法と比べて分離能を向上させることができ、蛋白スポットが密集する中性一弱酸性領域を約4倍に拡大することに成功した。この拡大画面による遺伝子の同定は今後の課題であるが、同定数の飛躍的な増加が期待される。
3.新方式の実用化は今後に残された課題である。
従来の標準法の装置は日本エイドーで製作販売されている。とくに、O'Farrell法では分離出来ない塩基性蛋白質の分析に威力を発揮しているが、販売実績は決して高いとは言えないし、装置としての改良の努力が不足している。新方式の実用化についてはメーカーの選択をも含めて再検討しなければならない。

研究成果

• [文献書誌] Tsutomu Suzuki, Maki Terasaki, Chie Takemoto-Hori, Takao Hanada, Takuya Ueda, Akira Wada, Kimitsuna Watanabe: "Proteomic analysis of the mammalian mitochondrial ribosome IDENTIFICATION OF PROTEIN COMPONENTS IN THE 28S SMALL SUBUNIT"J. Biol. Chem.. 276. 33181-33195 (2001)
• [文献書誌] Kaori Izutsu, Akira Wada, Chieko Wada: "Expression of ribosome modulation factor (RMF) in Escherichia coli requires ppGpp"Genes to Cells. 6. 665-676 (2001)
• [文献書誌] Tsutomu Suzuki, Maki Terasaki, Chie Takemoto-Hori, Takao Hanada, Takuya Ueda, Akira Wada, Kimitsuna Watanabe: "Structual compensation for the deficit of rRNA with proteins in the mammarian mitochondrial ribosome SYSTEMATIC ANALYSIS OF PROTEIN COMPONENTS OF THE LARGE RIBOSOMAL SUBUNIT FROM MAMMALIAN MITOCHONDRIA"J. Biol. Chem.. 276. 21724-21736 (2001)
• [文献書誌] Kaori lzutsu, Chieko Wada, Yuriko Komine, Tomoyuki Sako, Chiharu Ueguchi, Satomi Nakura, Akira Wada: "Escherichia coli ribosome-associated protein SRA, whose copy number increases during stationary phase"J. Bacteriol.. 183. 2765-2773 (2001)
• [文献書誌] Tetsuo Shirakawa, Yasushi Maki, Hideji Yoshida, Nobuko Arisue, Akira Wada, Lidya R.Sanchez, Fuminori Nakamura, Miklos Miller, Tetsuo Hashimoto: "Characterization of ribosomal proteins of the amitochondriate protist, Giardia lamblia"Mol. Biochem. Parasitol.. 112. 153-156 (2001)