2000 年度実績報告書

遺伝子ハンドリング技術を用いた単一細胞内調節タンパク質の機能解析法の開発

研究課題

研究課題/領域番号	11559016
研究機関	早稲田大学
研究代表者	石渡信一早稲田大学, 理工学部, 教授 (10130866)
研究分担者	藤田英明日本学術振興会, 特別研究員 (50318804) 岡野和宣 (株)日立製作所, 中央研究所, 主任研究員安田賢二東京大学, 総合文化研究科, 助教授 (20313158)
キーワード	ケージド遺伝子 / 温度パルス法 / DNAチップ / PCR法 / 筋芽細胞 / GFP-アクチン / アクチンフィラメント / ストレスセンサー
研究概要	Caged DNA合成の試み:Cagedのための一つの方策として、DNA塩基のアミノ基をDMNBB(4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl bromide)で化学修飾し、DNAの複製機能を一旦失活させ、それを紫外線マイクロフラッシュ法によって再活性化する、という方針で不活性化DNAの合成を試みた。一時はPCR法によって確認できたと思われたが、再現性に問題があり、結局DNA塩基のアミノが化学修飾に対して活性が高くない、という結論に達した。さらに、Caged遺伝子を調製したという論文が数編発表されたので、我々は方針を転換し、目的の研究課題の鍵となる新手法の開発に力を入れた。DNAの固定化と選択的回収法:クロム基盤上へのDNA固定化法と、赤外レーザー照射・温度パルス法による選択的な回収法を確立し、その方法の詳細を論文として公表した。GFP-アクチンの心筋培養細胞内発現:ニワトリの未分化筋芽細胞・マウス筋芽細胞株C2C12へ、蛍光タンパク質GFPをfusionしたアクチンのプラスミドを導入すること、そしてその未分化細胞を筋管へと分化させることを試みた。その過程でGFP-アクチンがどのように筋収縮系に組み込まれるかを、共焦点蛍光顕微鏡を用いて解析している。アクチンフィラメントのストレスセンサー応用:アクチンフィラメントに加わる張力を蛍光画像化し、アクチンフィラメントをストレスセンサーとして利用するための方法を開発しようと、幾つかの試みをした。特殊なGFP-アクチンを発現させ、加わる力に応じて生じるタンパク質歪みを蛍光画像化できるか否かを検討している。ケモカインリセプターの1分子画像化:細胞表面でケモカインリセプターを1分子蛍光画像化し、ケモカイン結合に伴う走化性と、レセプターの集合性や運動性を顕微鏡解析した。リセプターが2量体を形成するか否かに注目している。

研究成果

(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] 岡野和宣ら: "DNAプローブアレイを用いたDNA断片回収"電気学会誌(センサーマイクロマシン部内誌). 4月号(印刷中). (2001)
[文献書誌] Kawaguchi,K.and Ishiwata,S.: "Nucleoside-dependent single-to double-headed binding of kinesin"Science. 291. 667-669 (2001)
[文献書誌] Nishizaka,T. et al.: "Characterization of single actomyosin rigor bonds.-Load-dependence of lifetime and mechanical properties-"Biophys.J.. 79. 962-974 (2000)
[文献書誌] Kawaguchi,K.& Ishiwata,S.: "Temperature dependence of force, velocity and processivity of single kinesin melecules."Biochem.Biophys.Res.Comm.. 272. 895-899 (2000)
[文献書誌] Okano,K, et al.: "Position specific release of DNA from a chip by using photothermal denaturation."Sensors & Actuators. B64. 88-94 (2000)
[文献書誌] Yasuda,K. et al.: "Focal extraction of surface-bound DNA from a microchip using photo-thermal denaturation."Biotechniques. 28. 1006-1011 (2000)
[文献書誌] Ishiwata,S. et al.: "Molecular Interactions of Actin (eds.C.G.dos Remedios & D.D.Thomas)"Springer Verlag, Heidelbery. 269 (2000)

2000 年度 実績報告書

遺伝子ハンドリング技術を用いた単一細胞内調節タンパク質の機能解析法の開発

研究代表者

石渡 信一 早稲田大学, 理工学部, 教授 (10130866)

研究成果

[文献書誌] 岡野和宣 ら: "DNAプローブアレイを用いたDNA断片回収"電気学会誌(センサーマイクロマシン部内誌). 4月号(印刷中). (2001)

[文献書誌] Kawaguchi,K.and Ishiwata,S.: "Nucleoside-dependent single-to double-headed binding of kinesin"Science. 291. 667-669 (2001)

[文献書誌] Nishizaka,T. et al.: "Characterization of single actomyosin rigor bonds.-Load-dependence of lifetime and mechanical properties-"Biophys.J.. 79. 962-974 (2000)

[文献書誌] Kawaguchi,K.& Ishiwata,S.: "Temperature dependence of force, velocity and processivity of single kinesin melecules."Biochem.Biophys.Res.Comm.. 272. 895-899 (2000)

[文献書誌] Okano,K, et al.: "Position specific release of DNA from a chip by using photothermal denaturation."Sensors & Actuators. B64. 88-94 (2000)

[文献書誌] Yasuda,K. et al.: "Focal extraction of surface-bound DNA from a microchip using photo-thermal denaturation."Biotechniques. 28. 1006-1011 (2000)

[文献書誌] Ishiwata,S. et al.: "Molecular Interactions of Actin (eds.C.G.dos Remedios & D.D.Thomas)"Springer Verlag, Heidelbery. 269 (2000)

2000 年度実績報告書

石渡信一早稲田大学, 理工学部, 教授 (10130866)

[文献書誌] 岡野和宣ら: "DNAプローブアレイを用いたDNA断片回収"電気学会誌(センサーマイクロマシン部内誌). 4月号(印刷中). (2001)