| 研究概要 |
1.昨年度検討した基質リサイクリングに基づいて増幅応答を与えるマイクロ透析プローブバイオセンサーを,ラット脳内に埋め込み,脳細胞外L-グルタミン酸のin vivo計測に適用したところ,数μMに相当する応答を与え,KCl刺激に対してリアルタイムに明確な応答を与えたことから,本バイオセンサーがL-グルタミン酸のin vivo計測用センサーとして有用であることがわかった.
2.更に本年度はオンラインin vivo計測をめざして,マイクロダイアリシスプローブによる透析ラインと,増幅して計測するためのフローインジェクションラインを6方スイッチング自動バルブを用いて,交互に切り換えて連続測定が可能な計測システムに応用発展させた.L-グルタミン酸に対して増幅機能を有した酵素固定化リアクターを,L-グルタミン酸酸化酵素とグルタミン酸脱水素酵素を多孔性ガラスビーズに固定化して作製した.しかし,リンゲル液の透析流量が数μl/分であるので,酵素中に含まれる不純物酵素による影響がかなりあった.そこで問題となったNADHオキシダーゼとグルタミナーゼの不活性化法について検討した結果,簡便な操作で,L-グルタミン酸に対して特異的に働く増幅型酵素リアクターを開発できた.この計測システムを用いて,いろいろな刺激に対するラット脳細胞外L-グルタミン酸の濃度変動をオンラインで自動モニターできた.
この研究で開発したプローブ型バイオセンサーと酵素リアクターを組み込んだオンライン計測システムは,脳細胞外L-グルタミン酸のin vivo計測に適用でき,分子生物学の研究や新薬開発などの研究に新しい方法論として寄与できるものと考える.
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