| 研究課題/領域番号 |
11660005
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
育種学
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
村田 稔 岡山大学, 資源生物科学研究所, 教授 (20166292)
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| 研究分担者 |
小倉 豊 岡山大学, 資源生物科学研究所, 助手 (60224193)
坂本 亘 岡山大学, 資源生物科学研究所, 助教授 (20222002)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| キーワード | コムギ / 染色体DNAライブラリー / テロソーミック染色体 / マイクロダイセクション / DOP-PCR / 反復配列 / FISH / レトロトランスポゾン |
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| 研究概要 |
コムギ第1同祖群染色体に由来するDNAライブラリーを構築するため、六倍性コムギ(栽培種Chinese Spring)の異数体ダイテロソーミックス-1AL、-1AS-1BL、-1BS、-1DLとモノテロダイソーミックス-1DSから染色体標本を作製し、レーザマイクロダイセクションを行った。これまでは、テロ染色体以外の染色体をレーザにより消去し、残ったテロ染色体を鋭利なガラスニードルで削り取る操作を行ってきた。しかし、レーザを照射する際に染色体断片が飛び散り、ターゲットとする染色体上に残ることが考えられたため、レーザ照射を極力省き、直接ガラスニードルで削り取ることにした。その結果、4,5本のテロ染色体からでも十分なDNA増幅が行えた。増幅したDNAをプローブとしてFISH(蛍光in situハイブリダイゼイション)を行ったところ、特異的なシグナルは得られず、すべてのコムギ染色体の全体にシグナルが観察された。これは、増幅DNAに含まれている散在型反復配列(レトロトランスポゾン様配列など)によるものと考えられた。また、特異的に増幅するミニサテライトなども検出された。
これまでの解析から、増幅したDNA断片には、ESTや既知遺伝子のコーディング領域とホモロジーを示す配列がかなりの割合(〜40%)で含まれていることがわかった。そこで、これら遺伝子に相当するcDNAの直接選抜を試みた。プローブには、マイクロダイセクトした染色体からDOP-PCRで増幅したDNAを用い、これをビオチン化した。cDNAは、幼穂からポリA^+mRNAを抽出した後、SMART(クロンテック)により合成した。cDNAには、マイクロサテライトを含むものがあるため、ゲノミックDNAから調整したCot1 DNAをプレハイブリダイゼイションの段階で加えた。2回の直接選抜を行い、PCRを行ったところ、スメアの中に数本のバンドが観察された。現在、増幅したcDNAの解析を進めている。
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