| 研究概要 |
1ArabidopsisNa^+K^+トランスポーター遺伝子(AtHKT1)を大腸菌で発現させた。AtHKT1はK^+取り込み変異を相補したが小麦のホモログ蛋白質HKT1は大腸菌を相補しなかった。wHKT1が活性発現しなかった理由は明らかではない。次に、PhoAを用いたトポロジー解析を行った。更に、N末端についてはエピトープを導入して膜の内外について検討した。両者の方法から8回の膜貫通構造を有することをを明らかにした。AtHKT1が発現した大腸菌のK^+取り込み変異株のK^+取り込み活性測定を原子吸光分析法によって測定した。この結果、AtHKT1が発現する大腸菌と相補性を示さない大腸菌のK^+取り込み速度を比較した場合、Km値はほぼ同一であったがVmaxが1.7倍程度大きくなっていた。一方、植物K^+チャネル(KAT1およびAKT2)はK^+取り込み能を欠損した大腸菌を相補することを見いだしているが、K^+の取り込みは測定できなかった。パッチクランプ測定可能な大きさに大腸菌を巨大化し、大腸菌の細胞膜を対象に電気生理学的手法でK^+電流を測定すること成功した。
2 植物のK^+チャネルKAT1には糖鎖付加認識配列が存在するため、イヌの膵臓ミクロソームを用いて糖鎖の有無を検討した。しかし、KAT1は糖鎖修飾されないことが分かった
3 KAT1のイオン孔に存在するThr256をGlu(T256E),Gln(T256Q)に置換した変異体のNa^+阻害様式を卵母細胞発現系を用いた膜電位固定法によって検討したところ、-180mV以上の深い電位ではNa^+が貫通することが明らかとなった。
4 孔辺細胞由来の粗酵素抽出液とKAT1のC末領域とのリン酸化反応が起こることを確認した。
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