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枯草菌の胞子形成時において発芽時のコルテックス分解の「Key enzyme」であるアミダーゼ(SleB)がいつどの部位で特異的に生合成され、休眠胞子内でどのような局在性を示すかについて、また、SleBの構造等と局在化との関連についても解明を試みる。加えて、発芽時遊離は熱に対して抵抗性を持たないSleBの休眠胞子における耐熱性と酵素の局在性との関連について検討し、以下に示す成果を得た。
1.B.cereus及び枯草菌SleBに対する抗体を用いて休眠胞子における局在について検討するため、大腸菌に発現させた枯草菌SleBに対する特異的抗体を作製した。得られた抗体及び既に作成済みのB.cereus SleBに対する抗体を用いて、両菌休眠胞子の超薄切片にたいして免疫染色を行ってSleBが胞子最外層のコート層とコルテックス層との間に存在することを示し、本酵素が胞子表層の1成分であることを明らかにした。胞子の耐熱性は、これまで胞子内部の細胞質が高度に脱水化されていることに帰せられ、発芽時に作用する酵素群も細胞質内に存在して胞子表層の発芽に伴う分解は細胞内側から外に向かう過程と推察されてきた。しかしながら本研究の結果は、SleBによるコルテックス層の分解が胞子外縁から内側に向かって起きることを示唆し、発芽の分子過程や発芽酵素の耐熱性について従来の定説に再考を促すものとなった。
2.大腸菌-枯草菌間のシャトルベクターpHY300PLK上でsleB遺伝子のプロモーター領域と分泌シグナルを削除したSleBとを蛍光蛋白質の融合遺伝子を構築し、枯草菌に形質転換した。得られた形質転換株について胞子形成各期において蛍光顕微鏡下で観察することにより、SleBが胞子形成第III期にフォアスポア内部で生合成されることが明らかになった。
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