| 研究概要 |
1.ヒト由来ビタミンD_3 1α位水酸化酵素の構造と機能の解析
ヒト由来ビタミンD_3 1α位水酸化酵素(CYP27B1)正常型および変異型酵素化学的性質を調べることにより本酵素の構造と機能の解析を試みた。正常型およびくる病患者由来変異型8種および部位特異的により得た種々の変異型CYP27B1を大腸菌で発現させた。また、菌体における活性を上昇させるためにアドレノドキシンおよびNADPH-アドレノドキシン還元酵素との同時発現を試みた。これら組換え体の菌体培養液あるいは膜画分を用いて25-ヒドロキシビタミンD_3 1α位水酸化活性を測定した結果、高感度検出系である同時発現株菌体を用いても、くる病患者由来の8種の変異型CYP27B1はいずれも活性を示さなかった。8種の変異箇所について、さらに部位特異的変異を用いて種々の変異体を作製し、その性質を調べた結果、107Argおよび125Glyは基質結合に、321Thrは酸素の活性化に重要な役割を果たしていることが示唆された。
2.ヒト由来ビタミンD_3 24位水酸化酵素の酵素化学的性質
ヒト由来ビタミンD_3 24位水酸化酵素cDNAを単離し、大腸菌で発現させた。また、活性を上昇させるためにアドレノドキシンおよびNADPH-アドレノドキシン還元酵素との同時発現を試みた。菌体培養液あるいは膜画分に基質を添加し代謝産物をHPLCおよび質量分析計により分析した。25-ヒドロキシビタミンD_3を基質とし、代謝産物を分析したところ、24位水酸化に始まる代謝産物4種と23位水酸化に始まる代謝産物4種が検出された。24-代謝経路の代謝産物はラット由来CYP24の代謝産物と同様であったが、23-代謝経路はラットでは全く見られず、明らかな種差が認められた。HPLCおよび質量分析の結果から23-代謝経路における代謝産物は23,25-ジヒドロキシビタミンD_3および23,25,26-トリヒドロキシビタミンD_3,25-ヒドロキシビタミンD_3-26,23-ラクトールおよび25-ヒドロキシビタミンD_3-26,23-ラクトンであると推定された。本酵素を含む膜画分および同時発現株菌体は医薬用ビタミンD_3類縁化合物のヒト体内における代謝を予測するシステムとして有用であると考えられる。
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